細菌由来のD-アミノ酸含有ペプチド加水分解酵素に関する研究

细菌含D-氨基酸肽水解酶的研究

基本信息

批准号：
11760075
负责人：
米田英伸
金额：
$ 1.47万
依托单位：
Toyama Prefectural University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至 2000
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-11760075/
关键词：
D-アミノ酸ペプチダーゼ Bacillus cereus 遺伝子クローニング

项目摘要

我々は従来よりD-アミノ酸及びその誘導体の酵素的合成法の開発を目的として、自然界よりD-立体特異的ペプチダーゼ生産菌の探索を行ってきた。その中から得られたBacillus cereus DF4-B由来のアルカリD-ペプチダーゼは疎水性の高いD-アミノ酸のオリゴペプチド等にD-立体特異的に作用する新規なペプチダーゼである。このアルカリD-ペプチダーゼはD-アミノ酸含有ペプチドを加水分解するだけでなく、D-アミノ酸メチルエステルを基質とした場合、その加水分解と同時にオリゴマー合成を触媒する。そこで、本研究ではアルカリD-ペプチダーゼをD-アミノ酸含有ペプチド合成の触媒として応用することを目的とした。昨年度は本酵素遺伝子の周辺領域の一次構造解析を行うと同時に、組換え大腸菌における大量発現を検討した。今年度は、組換え体より本酵素を精製し、酵素法によるD-アミノ酸含有ペプチドの合成等、応用面での用途開発を検討した。まず、アルカリD-ペプチダーゼを発現した組換え体の培養条件を種々検討し、酵素活性を最大にするような条件を見い出した。さらに、高活性株から本酵素を単一に精製し、酵素化学的な諸性質を元株より精製したアルカリD-ペプチダーゼと比較検討した。次いで、精製酵素を用いてD-アミノ酸メチルエステルからのD-アミノ酸オリゴマーの合成条件を検討した。その結果、100mMのトリエチルアミン-塩酸(pH 11.5)の反応系で50mMの基質存在下、30℃、1時間反応を行ったところ、D-フェニルアラニンの2量体及び3量体の生成が最高となった。また、反応液中に添加した各種水溶性有機溶媒により2量体及び3量体の生成は著しく減少したが、一方でDMSOの添加により4量体の顕著な生成が認められた。

为了开发D-氨基酸及其衍生酶合成方法，我们一直在寻找与自然界相比的D-三维肽酶生产细菌。碱性D肽酶源自从其中的蜡状芽孢杆菌DF4-B衍生而来的是一种新肽酶，该肽酶作用于D特异性至D-氨基酸寡肽，这是高度疏水性的。碱D肽酶不仅水解了含D-氨基酸的肽，而且还与D-氨基酸的底物同时催化抑制了低聚物的合成。因此，在这项研究中，目的是将碱D肽酶应用于含D-氨基酸的肽合成的催化剂。去年，进行了该酶基因周围区域的主要结构分析，同时，我们检查了重组大肠杆菌的大量表达。今年，今年，该酶是从重组体中纯化的，并且考虑了应用应用的应用，例如通过酶方法合成含D-氨基酸的肽的应用。首先，我们检查了表达碱D肽酶的重组体的培养条件，并发现了最大化酶活性的条件。此外，该酶是从高度活跃的应变到碱D肽酶的酶化学特性的单个纯化，该酶是从前者菌株中改进的。接下来，使用纯化的酶检查了D-氨基酸甲基酯的D-氨基酸低聚物的合成。结果，当100mm三甲胺 - 盐酸的反应系统中存在50 mM的底物（pH 11.5）时，D-苯基丙氨酸的产生是D-苯基丙氨酸的最高产生。此外，在反应液中添加的各种水 - 溶剂有机溶剂可显着降低两个物体的产生，同时观察到DMSO的添加。