植物-菌根菌共生系に特異的なリン酸獲得・濃縮・輸送メカニズムの解明

阐明植物-菌根真菌共生系统特有的磷酸盐获取、浓缩和运输机制

基本信息

批准号：
13760050
负责人：
江澤辰広
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

アーバスキュラー菌根共生系におけるリン酸の獲得・濃縮・輸送のメカニズムを解明する目的で、共生特異的に宿主の根から分泌される酸性ホスファターゼの全長cDNAの塩基配列決定および遺伝子発現解析を行うと共に、菌根菌のプロトプラスト作製のための予備検討を行った。1.共生特異的酸性ホスファターゼの全長cDNA塩基配列の決定および遺伝子発現解析精製された共生特異的酸性ホスファターゼのN末端アミノ酸配列15残基を基にPCRプライマーを設計し、3'/5'RACE法によりcDNA(TPAP1)の全長塩基配列を決定した。TPAP1は,1,8kbpからなり,N末端部分に34残基のシグナルペプチドを含む466残基のアミノ酸をコードしていた.また,TPAP1の5'端非翻訳領域は,同遺伝子の3'端非翻訳領域と相補的な40塩基ほどの配列を有していた.RT-PCRとそれに続くサザンハイブリダイゼーションにより,菌根形成によるTPAP1mRNA発現量の変化を調べた.TPAP1の発現量は菌根形成により3〜10倍に増加した.また、TPAP1のC末端に対する抗体を用いたWestern blottingにより、TPAP1の定量を行ったところ、酵素活性の上昇と共にタンパク量も増加していたことから、本酵素の活性は遺伝子発現のレベルで制御されていることが示唆された。2.菌根菌プロトプラスト作製のための予備検討パッチクランプ法による菌根菌細胞膜上のリン酸輸送体の活性検出を目的として、アデレード大(オーストラリア)S. Tyerman教授のもとで菌根菌のプロトプラスト作製を試みた.高浸透液中で根細胞を酵素消化後、徐々に溶液の浸透圧を低下させると、菌糸の切断面からプロトプラストが突出してくる現象を認めた。今後はこの手法を用いて、Tyerman教授との共同研究でパッチクランプを行う予定である。

为了阐明羊膜菌根菌根共生系统中磷酸盐采集，富集和运输的机制，我们对宿主根部专门分泌的酸性磷酸酶的全长cDNA进行了测序和基因表达分析，并进行了从宿主根部分泌的酸性cDNA，并为生产Mycorrhizal fungi进行了初步研究。 1。基于3'/5'种族方法，确定了共生特异性酸性磷酸酶的全长cDNA核苷酸序列和基因表达分析PCR引物的确定基于15种纯化的N末端氨基酸磷酸磷酸酶的N-末端氨基酸序列的残基，并通过3'/5'种族方法确定了全长长长cDNA（TPAP1）。 TPAP1由1,8 kbp组成，编码了466个氨基酸，其中含有N末端部分的34个残基的信号肽。 TPAP1的5'-末端未翻译区域的序列约为40个基因的3'-末端未翻译区域的基础。通过RT-PCR和随后的南部杂交，检查了由于菌根形成而引起的TPAP1 mRNA表达水平的变化。由于菌根的形成，TPAP1的表达水平增加了3-10倍。此外，通过使用对TPAP1 C末端的抗体进行蛋白质印迹来量化TPAP1，并且随着酶活性的增加，蛋白质水平增加，这表明该酶的活性在基因表达水平下受到调节。 2。生产菌根真菌原生质体的初步研究，我们试图在阿德莱德大学（澳大利亚）的S. tyerman教授的领导下生产菌根真菌原生质体。在高度渗透溶液中根细胞的酶消化后，逐渐降低了溶液的渗透压，并且观察到原生质体从菌丝体的切面表面突出。将来，我们计划使用此方法与Tyerman教授合作执行补丁夹。