微細加工技術による心筋細胞への配向性の付与と3次元培養法の確立

利用微细加工技术为心肌细胞添加定向并建立三维培养方法

• 批准号: 13780693
• 负责人: 清水 達也
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: Tokyo Women's Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13780693/
• 关键词: 細胞シート; 微細加工; 心筋再生; 配向性; 心筋細胞

本研究は培養皿表面の親水・疎水の温度による変化や微細なパターン化により培養心筋細胞の形態制御や移動・重層化を行い、重症心不全に対する移植心筋組織創成のための基盤技術を確立することを目的とした。シート状の心筋細胞シートの作製には、温度応答性高分子イソプロピルアクリルアミドを電子線を用いグラフトした培養皿を用いた。培養温度である37℃では細胞接着性であるが、32℃以下の低温処理にて細胞非接着性となり細胞が脱着、トリプシンなどの蛋白分解酵素使用時のような細胞間接着の解離は起こさず維持されるためシート状の心筋細胞が回収可能となった。この心筋細胞シートを積層化したところ心筋細胞シート間に電気的・形態的な結合が生じ同期して拍動することが示された。本研究においては4層までの積層化を実現、ヌードラットの背部皮下組織にて1年まで拍動を維持し生存することが確認された。また、心筋細胞に配向性を付与する目的で、温度応答性および細胞非接着性表面のストライプパターンの培養皿を作製した。具体的には、温度応答性培養皿上にストライプ状のマスクパターンを使い、高親水性のアクリルアミドをストライプ状に電子線重合した。これにより100μm幅のストライプ状の温度応答性の表面が作製可能となった。このパターン化した表面に心筋細胞を培養したところ、心筋細胞が温度応答性の表面にのみ接着、細胞が一方向にしか伸展できず配向性を獲得した。低温処理を行ったところ、配向した糸状の心筋組織が脱着、長軸方向に収縮弛緩する糸状の心筋組織が再構築された。今後、本研究の成果を基盤に、培養皿内に多数のストライプパターンを作製しスケールアップしたものを作製、低温処理にて配向性を持った心筋細胞シートを作製、重層化技術との融合により3次元配向心筋組織の構築をめざす。

本研究的目的是通过改变培养皿表面的亲水/疏水温度和创建精细图案来控制培养的心肌细胞的形态、迁移和分层，建立用于严重心力衰竭的移植心肌组织的基础技术目的是。使用电子束接枝有温度响应性聚合物异丙基丙烯酰胺的培养皿来制备片状心肌细胞片。细胞在37°C的培养温度下具有粘附性，但在32°C或更低的低温下处理时，细胞变得非粘附性并且细胞分离，不会像使用蛋白水解酶时那样导致细胞与细胞粘附的解离其结果，可以回收片状的心肌细胞。当这些心肌细胞片堆叠在一起时，心肌细胞片之间会产生电和形态连接，从而导致它们同步跳动。在这项研究中，我们实现了多达四层的分层，并证实它可以在裸鼠背部的皮下组织中保持其脉动并存活长达一年。此外，为了赋予心肌细胞定向性，制作了具有温度响应性且非细胞粘附表面的条纹图案培养皿。具体而言，使用温度响应型培养皿上的条纹掩模图案，通过电子束以条纹图案聚合高亲水性丙烯酰胺。这使得可以制造宽度为100μm的条纹温度响应表面。当心肌细胞在这种有图案的表面上培养时，它们仅粘附在温度响应表面上，并且细胞只能向一个方向扩张并获得定向。当进行低温处理时，定向的丝状心肌组织被剥离，并重建了沿纵向收缩和舒张的丝状心肌组织。未来，基于这项研究成果，我们将通过在培养皿中创建许多条纹图案来创建放大版本，通过低温处理创建定向心肌细胞片，并将其与分层技术相结合来构建。三维定向的心肌组织。

项目成果

Shimizu T, Yamato M, Kikuchi A, Okano T.: "Cell sheet engineering for Myocardial tissue reconstruction"Biomaterials. (in press). (2003)

Shimizu T、Yamato M、Kikuchi A、Okano T.：“用于心肌组织重建的细胞片工程”生物材料。

Shimizu T, Yamato M, Akutsu T et al.: "Fabrication of pulsatile cardiac tissue grafts using a novel 3-dimensional cell sheet manipulation technique and temperature-responsive cell culture surfaces"Circulation Research. 90(3). e40-e48 (2002)

Shimizu T、Yamato M、Akutsu T 等人：“使用新型 3 维细胞片操作技术和温度响应细胞培养表面制造脉动心脏组织移植物”循环研究。

Shimizu T, Yamato M et al: "Fabrication of Pulsatile Cardiac Tissue Grafts Using a Novel 3-Dimensional Cell Sheet Manipulation Technique and Temperature Responsive Cell Culture Surfaces"Circulation Research. 90. e40-e48 (2002)

Shimizu T、Yamato M 等人：“使用新型 3 维细胞片操作技术和温度响应细胞培养表面制造脉动心脏组织移植物”循环研究。