CTDホスファターゼFCP1によるRNAポリメラーゼIIの制御機構の解析

CTD磷酸酶FCP1对RNA聚合酶II的调控机制分析

• 批准号: 13780563
• 负责人: 木村 誠
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: National Institute of Genetics
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13780563/
• 关键词: RNAポリメラーゼII; 転写因子; ホスファターゼ; エピトープタグ; RNAポリメラーゼ; リン酸化; 分裂酵母

RNAポリメラーゼII(Pol II)第1サブユニット(Rpb1)のC末端ドメイン(CTD)は、7アミノ酸残基による高度反復配列で構成され、転写サイクルの中で高度リン酸化、脱リン酸化を繰返し受ける。これが最も顕著なPol IIの制御機構である。昨年度までに、Rpb1遺伝子にエピトープタグ配列を導入した分裂酵母株から、Pol II基本転写因子TFIIF、CTDの脱リン酸化を担うホスファターゼFcp1の複合体の単離に成功し、Pol II第4サブユニット(Rpb4)がFcp1をPol IIに結合させ、CTDの脱リン酸化を促進する機能をもつことを明らかにしている。今年度は、1.試験管内転写系でのFcp1-Rpb4相互作用の果たす機能を解析するため、解析に有効な分裂酵母株の抽出液による試験管内転写系の構築を行った。2.Rpb4の機能解析のため、野生型Rpb4の発現停止後に部分欠損をもつ変異Rpb4を発現する酵母株を作製し、変異Rpb4の細胞内での機能を解析した。N及びC末端領域は細胞の生育には不要であるが、C末欠損Rpb4は優勢の生育遅延を見せた。また、致死性変異Rpb4はPol IIへの集合が見られなかった。Rpb4の機能とその作用機構について引き続き解析中である。3.Fcp1遺伝子にエピトープタグ配列をもつ分裂酵母株から、Fcp1を含む新規複合体である可能性の高い蛋白質複合体を単離した。大量精製と構成因子の同定を検討中である。4.酵母細胞内でのFcp1、TFIIF、Pol IIの動態について解析するため、Fcp1、TFIIFの細胞内分子数を定量した。細胞当りPol II-10,000分子に対し、Fcp1-3,500、TFIIF-20,000分子であった。

RNA聚合酶II的第一个亚基的C末端结构域（CTD）（POLI II）（RPB1）由具有7个氨基酸残基的高度重复序列组成，并在转录循环中经历重复的高磷酸化和去磷酸化。这是Pol II最突出的控制机制。 By last year, we have successfully isolated a complex of Pol II basic transcription factor TFIIF and the phosphatase Fcp1, which is responsible for dephosphorylation of CTDs, from a fission yeast strain that has introduced an epitope tag sequence into the Rpb1 gene, and it has been revealed that Pol II fourth subunit (Rpb4) binds Fcp1 to Pol II and promotes dephosphorylation of CTD。今年，为了分析FCP1-RPB4相互作用在体外转录系统中的功能，我们使用裂变酵母菌菌株的提取物构建了一个体外转录系统，这对于分析有效。 2.为了分析RPB4函数，制备了野生型RPB4表达后，表达突变体RPB4的酵母菌菌株，并分析了突变体RPB4在细胞中的功能。 N和C末端区域对于细胞生长不是必需的，但是C末端缺乏RPB4显示出主要的生长迟缓。此外，未发现致命突变​​体RPB4聚集到Pol II中。 RPB4及其作用机理的功能正在继续进行分析。 3.可能是含有FCP1的新型复合物的蛋白质复合物是从FCP1基因中具有表位标记序列的裂变酵母菌菌株中分离出来的。正在考虑大量纯化和鉴定组成因素。 4。为了分析酵母细胞中FCP1，TFIIF和POL II的动力学，定量了FCP1和TFIIF的细胞内分子的数量。每个细胞的FCP1-3,500和TFIIF-20,000分子为FCP1-3,500和TFIIF-20,000分子。

项目成果

Makoto Kimura: "Formation of a carboxy-terminal domain phosphatase (Fcp1)/TFIIF/RNA polymerase (pol II) compiex in Schizosaccharomyces pombe involves direct interaction between Fcp 1 and the Rpb4 subunit of pol II"Molecular and Cellular Biology. 22-5. 157

Makoto Kimura：“粟酒裂殖酵母中羧基末端结构域磷酸酶 (Fcp1)/TFIIF/RNA 聚合酶 (pol II) 复合物的形成涉及 Fcp 1 和 pol II 的 Rpb4 亚基之间的直接相互作用”《分子与细胞生物学》。