多機能プロテアーゼインヒビター創製のための基礎研究

多功能蛋白酶抑制剂的基础研究

• 批准号: 08660059
• 负责人: 木村 誠
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08660059/
• 关键词: プロテアーゼインヒビター; タンパク質工学

デイゴ種子キモトリプシンインヒビターECIは、1分子で2分子のキモトリプシンを阻害することが推定されているが、その詳細な阻害機構は不明である。本申請研究では、ECIの第一の反応部位Leu^<64>を他の19種のアミノ酸に置換した変異体と、N末端10アミノ酸残基を削除した欠損体、さらにECIに存在する4つのループ構造の各2残基を欠損した4種の変異体を作製し、それらのキモトリプシン阻害活性を調べた。Leu^<64>の変異体とループ構造の変異体は、それぞれ変異を導入したプライマーを用いた部位特異的置換法により、またN末端10アミノ酸残基の削除は、PCR法により作製した。変異体遺伝子の大腸菌内での発現は、発現ベクターとしてpET-22b、宿主菌としてBL21(DE3)株を用いた。キモトリプシンに対する阻害活性は、カゼイン法を用いて測定した。その結果、64位をアルギニン、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、およびメチオニンに置換した変異体は、野生型とほぼ同程度の阻害活性を保持していたが、その他のアミノ酸に置換した変異体の阻害活性は野生型の約1/5に低下していた。N末端10アミノ酸残基を削除した変異体は、ほとんど阻害活性を示さなかったが、4種のループ構造の変異体は完全な阻害活性を保持していた。本研究より、ECIにおいて、第一の反応ループの周辺構造がキモトリプシンとの相互作用に重要であることが示唆された。今後、第一の反応ループに位置する各アミノ酸の阻害活性への寄与をさらに詳細に調べていきたい。

据估计，ECI是一种Deigot种子胰凝乳蛋白酶抑制剂，可以用一个分子抑制两个分子，但详细的抑制机制尚不清楚。在这项申请研究中，我们创建了突变体，其中ECI的第一个反应性位点被其他19个氨基酸取代，其中有缺陷的身体删除了N末端10氨基酸残基，并检查了ECI中存在的四个LOOP结构中的两个残基，并删除了其壳蛋白蛋白酶抑制素活性。 Leu^<64>突变体和环结构突变体分别通过位点特异性取代制备，使用引入突变的引物，并通过PCR进行N端10氨基酸残基的缺失。为了表达突变基因在大肠杆菌中的表达，将PET-22b用作表达载体，BL21（DE3）用作宿主细菌。使用酪蛋白法确定对胰胆红蛋白的抑制活性。结果，突变体用精氨酸，色氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸和蛋氨酸取代了位置64，与野生型保持了几乎相同的抑制活性，但是被其他氨基酸代替的突变体的抑制活性降低至野生型的约1/5。删除N末端10氨基酸残基的突变体几乎没有抑制活性，而四个环结构突变体保留了完全抑制活性。这项研究表明，第一个反应环的外围结构对于与ECI中与胰凝乳蛋白酶的相互作用很重要。将来，我们将更详细地研究位于第一个反应环中的每个氨基酸对抑制活性的贡献。

项目成果

Yoshiaki Kouzuma et al.: "Purification, Characterization, and Sequencing of Two Cysteine Proteinase Inhibitors, Sca and Scb, from Sunflower(Helianthus annuus)Seeds" J.Biochem.119. 1106-1113 (1996)

Yoshiaki Kouzuma 等人：“来自向日葵种子的两种半胱氨酸蛋白酶抑制剂 Sca 和 Scb 的纯化、表征和测序”J.Biochem.119。

Tomohiro Nakagaki et al.: "Inhibitory Potency of Erythrina variegata Proteinase Inhibitors toward Serine Proteinases in the Blood Coagulation and Fibrinolytic Systems" Biosci, Biotech, Biochem.60・8. 1383-1385 (1996)

Tomohiro Nakagaki等：“刺桐蛋白酶抑制剂对血液凝固和纤维蛋白溶解系统中丝氨酸蛋白酶的抑制效力”Biosci，Biotech，Biochem.60・8（1996）。

Jun-ichi Kuramitsu: "Molecular Cloning of cDNA That Encodes Chymotrypsin Inhibitor ECI from Erythrina variegata Seeds and Its Expression in Escherichia coli" Biosci, Biotech, Biochem. 60・9. 1469-1473 (1996)

Jun-ichi Kuramitsu：“从刺桐种子中编码胰凝乳蛋白酶抑制剂 ECI 的 cDNA 的分子克隆及其在大肠杆菌中的表达”Biosci，Biotech，Biochem 1469-1473。