癌特異的な分泌型シアル酸転移酵素の形成機構

癌症特异性分泌型唾液酸转移酶的形成机制

基本信息

批准号：
13780512
负责人：
北爪しのぶ
金额：
$ 1.34万
依托单位：
The Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

本年度は、詳細な解析の結果、膜に結合したシアル酸転移酵素ST6Gal lはBACE1で切断された後、単純に細胞外に可溶型酵素として分泌されるわけではなく、実は細胞内輸送過程で巧妙なプロセシングを受けた末に分泌されることを見出した。まず第一に本研究者らはin vitroでST6Gal lをBACE1で切断する実験系を確立し、切断部位を調べることにした。ST6Gal lの切断部位を含む18〜20アミノ酸残基から成る合成ペプチドを基質とし、BACE1-Fcを用いて酵素反応を行い、、MALDI-TOFMSを用いて反応産物の解析を行った。その結果、in vitroの実験では、BACE1はST6GallをGln^<37>とLeu^<38>の間で切断することが明らかになった。本研究者らは、ST6Gal lがBACE1によってGln^<37>とLeu^<38>の間で切断された後(以後、この反応産物をST6Gal l Q38型と呼ぶ)に分泌されるまでの過程において、何らかのプロテアーゼ活性がアミノ末端側のQAKという3アミノ酸残基を切断するのでないか、と推測し、このような酵素活性の検出を目指した。ST6Gal l Q38型を基質とし、培養細胞から調製したミクロソーム画分を酵素画分として酵素反応を行い、反応産物をE41抗体で免疫染色することで酵素活性を検出することを試みた結果、ミクロソーム画分を界面活性剤で可溶化した時のみ酵素活性が見出されたことから、膜内腔側にプロテアーゼ活性が存在することが想像された。このようなプロテアーゼ活性は、ST6Gal lをBACE1が切断した後のQ38型にのみ作用し、ST6Gal lそのものを基質としないことから、エキソペプチダーゼに属すると考えられる。

今年，我们发现经过详细的分析，将膜结合的siAllyltransferase st6gal L用Bace1裂解，然后分泌为可溶性酶，而不仅仅是外源加工，而是通过外源加工，而是在细胞内运输过程中进行裂解处理后实际分泌。首先，研究人员在体外建立了一个用Bace1切割ST6GAL L的实验系统，并决定研究裂解位点。底物是由含有ST6GAL L裂解位点的18至20个氨基酸残基组成的合成肽，并使用BACE1-FC进行了酶促反应，并使用MALDI-TOFMS分析了反应产物。结果表明，体外实验Bace1在Gln^<37>和Leu^<38>之间切割了ST6GALL。研究人员推测，在Bace1（以下称为ST6GAL L Q38型）之间在Gln^<37>和Leu^<38>之间切割ST6GAL L的过程中，一些蛋白酶活性裂解了三种氨基酸残基在氨基终端上称为QAK的三个氨基酸残基，并旨在检测这种Enzyme活动。使用ST6GAL L Q38作为底物，将用培养细胞制备的微粒体馏分用作酶馏分，并通过用E41抗体的反应产物进行免疫染色来检测酶活性。结果，仅当微粒体馏分用表面活性剂溶解时才发现酶活性，并且可以预见蛋白酶活性存在于膜腔侧。这种蛋白酶活性被认为属于雌激酶，因为它仅影响Bace1裂解后的Q38类型，并且不使用ST6GAL L作为底物。