ヒト正常細胞を用いた癌遺伝子の研究

利用正常人体细胞研究癌症基因

• 批准号: 13214112
• 负责人: 赤城 剛
• 金额: $ 3.26万
• 依托单位: Osaka Bioscience Institute
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13214112/
• 关键词: 遺伝子; 細胞・組織; シグナル伝達; 癌; 老化; ras; SV40 T抗原; EIA

1.ヒト正常繊維芽細胞への高効率安定遺伝子導入法の確立。ヒト正常細胞を用いた癌遺伝子の研究が進まなかった背景には、正常細胞の特質に由来する技術的な困難さがある。すなわち、正常細胞は一般の細胞株と比較してconventionalなトランスフェクションによる遺伝子導入の効率が極めて悪いこと。分裂寿命を有するために、限られた回数しか分裂できないこと。細胞密度が低い状態だと増えにくいこと。などの理由により、安定な外来遺伝子導入細胞を作製し生化学的な解析を行うのに十分な数まで殖やすことが非常に困難であった。特に、ヒトの正常細胞をトランスフォームさせようとすると、複数の遺伝子を安定に導入する必要があり、これを従来のトランスフェクションで行うのは事実上、不可能であると思われる。この目的には、レトロウイルスベクターを用いるのが最も適しているが、癌遺伝子を扱うので、バイオハザードの観点からも、ヒトに感染するamphotropic retrovirus(ARV)は極力使わない方が望ましい。そこで、まず最初に、齧歯類にのみ感染するecotropic retrovirus(ERV)のレセプター遺伝子をヒト正常細胞に導入し(この際には、ARV vectorを使わざるを得ない。)、一旦、その様な細胞を得てからは、ERV vectorを用いて、外来遺伝子の導入を行うというストラテジーを取った。TIG-1、TIG-3、MRC-5、IMR-90、BJなどのこれまで細胞老化の研究に良く用いられてきたヒト正常2倍体繊維芽細胞(HDF)に、ERVのレセプター遺伝子を導入したところ、これらのHDFは、マウスERV vectorに対して大変感受性が高く、我々が開発したCX4レトロウイルスベクターと北村俊雄博士(東大医科研)らが開発したERV packaging細胞Plat-Eを組み合わせて使うことによって非常に高い効率(ほぼ100%)で外来遺伝子を安定に導入することが可能になった。2.正常繊維芽細胞への癌遺伝子の導入。上記のシステムを用いて不死化を起こす遺伝子(テロメラーゼの触媒サブユニットcDNAやc-myc)、癌抑制遺伝子であるRbやp53を不活化する遺伝子(SV40 T抗原、アデノウイルスのE1A、あるいは変異型p53)、優性な癌遺伝子(活性化型H-ras)の少なくとも3つのカテゴリーの遺伝子を、単独またはいくつかの組み合わせで導入したHDFを得ることに成功した。

1。为人正常成纤维细胞建立高效的稳定基因转移方法。使用正常人细胞对癌基因的研究缺乏进展的原因是正常细胞的特征引起的技术困难。换句话说，与一般细胞系相比，正常细胞通过常规转染的基因转染效率极差。要拥有裂变寿命，只能仅分配有限的次数。如果细胞密度较低，很难增加。由于这些原因，很难生长到足够数量的细胞来产生稳定的外国基因转染细胞并进行生化分析。特别是，在尝试转化正常的人类细胞时，需要稳定地引入多个基因，并且看来几乎不可能通过常规转染进行此基因。尽管它最适合此目的，但使用逆转录病毒载体，因为它们从生物危害的角度处理癌基因，因此避免使用尽可能多地感染人类的​​两性逆转录病毒（ARV）。因此，首先，将感染啮齿动物的生态逆转录病毒（ERV）的受体基因引入了正常的人类细胞中（在这种情况下，ARV载体被迫使用），一旦获得了此类细胞，一旦获得了ERV载体来引入外源基因。当将ERV的受体基因引入人类正常二倍体成纤维细胞（HDFS）时，这些受体通常用于细胞衰老研究中，例如Tig-1，Tig-3，MRC-3，MRC-5，IMR-90和BJ Kitamura Toshio（东京大学医学研究所）等，有可能稳定地引入具有很高效率的外国基因（几乎100％）。 2。将癌基因引入正常的成纤维细胞。使用上述系统，我们成功获得了至少三类基因的HDF：使永生化的基因（催化亚基cDNA或C-MYC），使肿瘤抑制基因RB和p53失活的基因RB和p53（SV40 T抗原，Adenovirus E1A，Adenovirus E1A和Mutant wescent和strimant pronant onert onert on trim p53）（sv40 T）单独或组合引入。