プロモータートラップを用いたT細胞活性化に伴って誘導される遺伝子の検索

使用启动子陷阱寻找 T 细胞激活时诱导的基因

基本信息

批准号：
13206010
负责人：
山崎晶
金额：
$ 1.73万
依托单位：
Chiba University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

<背景と目的>本研究は、マーカー遺伝子がランダムに挿入されたプロモータートラップ細胞ライブラリーを用いて、未知遺伝子も含め、特定の発現パターンを示す遺伝子群を網羅的に解析することを目的とする。具体的には、T細胞をモデルとしてGFP、或いはβ-Geoをマーカーとしたプロモータートラップ細胞ライブラリーを構築し、様々なT細胞抗原受容体(TCR)刺激に伴って発現が上昇する遺伝子(群)を探索する。以上の解析により方法論を確率し、広く様々な細胞への応用をはかる。また、得られた細胞クローンをさらに刺激の種類、時間、免疫抑制剤の有無で比較し、特異的に誘導される遺伝子のパターンを明らかにする。すなわち、多様なT細胞応答を規定する遺伝子発現パターンを網羅的に解析するのみならず、既知遺伝子だけでなく、未知遺伝子をも対象としたクラスター解析の方法論確立を目的としたものである。<検討結果>1)GFP、blastcidine deaminase-Geoをレポーターとしたレトロウイルストラップベクターを構築し、実際にトラップベクターとして機能することを確認した。2)TCR刺激に対して死を起こさない抗原特異的T細胞ハイブリドーマ2B4PTを樹立し、この細胞を用いてT細胞トラップライブラリーを構築した。3)T細胞トラップライブラリーより、抗TCR抗体刺激に応答してレポーター遺伝子の発現が有意に上昇するクローンを、GFPを指標としたcell sorting、β-Geoを用いた薬剤耐性能により取得した。それらの応答クローンより、RACE法を用いてトラップされた遺伝子を単離した。単離された遺伝子はそれぞれ、known4個、unknown3個であり、何れもこれまでTCR下流での誘導が報告されていないものであった。<考察>本法で用いたトラップベクターを用いることで、これまでTCR刺激による誘導が報告されていない遺伝子、特に転写、翻訳に関わる因子を効率よく同定できることが判明した。今後このトラップ細胞ライブラリーのサイズを拡大し、刺激の差異によって発現が変化する遺伝子を網羅的に探索していく予定である。

<背景和目标>本研究的目的是使用启动子陷阱细胞库，在其中随机插入了标记基因的启动子陷阱细胞库，这些基因（包括未知基因）表现出特定的表达模式，包括未知基因。具体而言，使用GFP或β-GEO作为标记物构建使用T细胞作为模型的启动子捕获细胞文库，以及搜索随着各种T细胞抗原受体（TCR）刺激的表达增加的基因（组）。上述分析允许方法的概率，可以广泛应用于各种细胞。此外，通过刺激，时间和存在或不存在免疫抑制剂的类型，进一步比较了所获得的细胞克隆，以阐明特异性诱导的基因模式。换句话说，目的不仅要全面地分析定义各种T细胞反应的基因表达模式，而且还建立了一种用于群集分析的方法，该方法不仅针对已知基因，还针对未知基因。 <结果> 1）我们使用GFP和BlastCidine Deaminase-Geo作为记者构建了逆转录病毒陷阱载体，并确认它实际上是陷阱矢量的作用。 2）建立不会导致TCR刺激死亡的抗原特异性T细胞杂交瘤2B4PT，并使用这些细胞构建了T细胞陷阱库。 3）使用细胞分类和使用GFP作为指标，从T细胞陷阱文库中获得了对抗TCR抗体刺激的反应显着增加报告基因表达的克隆。从这些响应克隆中，使用种族方法分离了捕获的基因。分离的基因是4个已知和3个未知数，并且以前尚未在TCR下游报道诱导。 <讨论>已经发现，通过使用该方法中使用的陷阱向量，可以有效地鉴定出尚未通过TCR刺激（尤其是参与转录和翻译涉及的因素）诱导的基因。将来，我们计划扩大此陷阱细胞库的大小，并全面探索其表达因刺激差异而变化的基因。