プロテインチップによる内分泌撹乱物質のリスクアセスメント法の開発

利用蛋白质芯片开发内分泌干扰物风险评估方法

基本信息

批准号：
13027269
负责人：
村田正治
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

バクテリア発現系によって、ヒトエストロゲンレセプターリガンド結合ドメイン(hER-LBD)をヒスチジンタグとの融合タンパク質として大量発現させた。これを新たに合成した末端チオール化ニトリロトリ酢酸(NTA)誘導体と金属イオンを介して結合、さらに金-チオール間の化学吸着現象を利用することによって、hER-LBD三元複合体を金ディスク電極表面上へ固定化した。リガンドとの結合実験はサイクリックボルタンメトリーによって行った。hER-LBD固定化電極を測定溶液に浸積し、これに所定の濃度の17β-エストラジオールを加えて電気化学的応答を観察したところ、添加したエストラジオールの濃度に応じてピーク電流値が大きく減少した。この現象はhER-LBDを固定化していない電極では全く観察されなかったことから、ピーク電流値の減少は電極表面上におけるレセプター-リガンド間の特異的な相互作用によるものと示唆された。女性ホルモンの添加濃度とピーク電流の減少量との関係をプロットした結果、得られた検量線は10^<-10>Mから10^<-7>Mまで線形応答が得られており、その検出感度はRI標識リガンドを用いた競合アッセイ法に匹敵した。ERはリガンドとの結合によって、その立体構造を変化させホモ二量体を形成することが知られている。本検出系では、このコンホメーション変化にともなって大きく変化したタンパク質の表面物性を、マーカーイオンの透過性に基づく電気化学的応答によって捉えたものと考えられる。このセンサは17β-エストラジオールに対して優れた応答特性を示した。本バイオセンサの測定時間は約1分と極めて高速であり、その検出感度も従来法に匹敵したことから、内分泌撹乱物質に対する新しいセンシングシステムとして有効である。

人雌激素受体配体结合结构域（HER-LBD）用细菌表达系统表示为带有组氨酸标签的融合蛋白。这与新合成的末端硫醇化硝基三环酸（NTA）衍生物结合，通过金属离子衍生物，并利用金硫醇化学吸收现象，将HER-LBD三元络合物固定在金盘电极的表面上。与配体的结合实验是通过环状伏安法进行的。将HER-LBD固定电极浸入测量溶液中，并将以给定浓度的17β-雌二醇添加到溶液中以观察电化学响应。响应添加的雌二醇的浓度，峰值电流值显着降低。在没有固定Her-LBD的电极上，根本没有观察到这种现象，这表明峰值电流值的降低是由于电极表面上的特定受体配体相互作用引起的。绘制了女性激素浓度的浓度与峰值电流减小的量之间的关系，所获得的校准曲线产生了从10^<-10> m到10^<-7> m的线性响应，检测敏感性与使用RI标记的配体的竞争分析相当。众所周知，ER通过结合配体形成同二聚体来改变其构象。在此检测系统中，人们认为，基于标记离子的渗透性，电化学响应捕获了对这种构象变化发生巨大变化的蛋白质的表面特性。该传感器对17β-雌二醇具有出色的响应特征。该生物传感器的测量时间非常快，大约1分钟，并且其检测敏感性与常规方法相当，使其成为内分泌干扰剂的有效新感应系统。