プロテインチップによる内分泌撹乱物質の高速リスクアセスメント法の開発

利用蛋白质芯片开发内分泌干扰物高速风险评估方法

基本信息

批准号：
14042249
负责人：
村田正治
金额：
$ 2.56万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2003
项目状态：
已结题

项目摘要

バクテリア発現系によって、ヒト甲状腺ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン(hTR-LBD)をヒスチジンタグとの融合タンパク質として大量発現させた。これを末端チオール化ニトリロトリ酢酸(NTA)誘導体と金属イオンを介して結合、さらに金-チオール間の化学吸着現象を利用することによって、hER-LBD三元複合体を金ディスク電極表面上へ固定化した。リガンドとの結合実験はサイクリックボルタンメトリーによって行った。hTR-LBD固定化電極を測定溶液に浸積し、これに天然の甲状腺ホルモン、トリヨードサイロニン(T3)を添加し、その電気化学的応答を測定した。この結果、hTR-LBD固定化電極は、期待通り甲状腺ホルモンに対して濃度依存的にピーク電流値の値を変化させた。電流値の変化量を縦軸に、T3濃度を横軸にとってプロットしたところ、直線性の高い検量線が得られた。hTR-LBD固定化電極は10^<-9>という極めて低濃度から感度良く甲状腺ホルモンに応答し、レセプター固定化電極の高いポテンシャルが示された。一方、対照として使用した化学物質ジメチルスルホキシドに対しては、hTR-LBD固定化電極はほとんど応答しなかった。これらの結果から、これまで検討を続けてきたレセプター固定化電極が、ヒトエストロゲンレセプター、ヒトダイオキシンレセプターに続き、ヒト甲状腺ホルモンレセプターについても応用できることが確認された。甲状腺ホルモンレセプターは、内分泌撹乱物質のみならず、肥満や心臓疾患等との関連から医学・薬学分野でも注目されており、臨床応用への展開も期待できる。

人甲状腺激素受体配体结合结构域（HTR-LBD）以细菌表达系统的组氨酸标记大量表示，以大量融合蛋白表达。这与末端的二硝基三环酸（NTA）通过金属离子结合，并通过利用金硫醇化学吸收现象，将HER-LBD三元络合物固定在金盘电极的表面上。与配体的结合实验是通过环状伏安法进行的。将HTR-LBD固定电极浸入测量溶液中，并向其添加天然甲状腺激素三碘甲醇（T3）以测量其电化学反应。结果，正如预期的那样，HTR-LBD固定电极的峰值电流值相对于甲状腺激素以浓度依赖性方式变化。当将电流值的变化绘制在垂直轴上和水平轴上T3的浓度上时，获得了高度线性校准曲线。 HTR-LBD固定电极对甲状腺激素的反应非常低，浓度为10^<-9>，并显示出受体固定电极的高电位。另一方面，HTR-LBD固定电极对用作对照的化学二甲基硫氧化物几乎没有响应。这些结果证实，到目前为止已经研究的受体 - 弹性电极可以应用于人类甲状腺激素受体以及人雌激素受体。甲状腺激素受体不仅吸引了内分泌干扰物的注意力，而且由于其与肥胖和心脏病的关联而引起了医学和药房领域的关注，并且预计将扩展到临床应用中。