タンパクアレイを指向した新規タンパク固定化センサを用いるタンパク機能評価システム

使用面向蛋白质阵列的新型蛋白质固定传感器的蛋白质功能评估系统

基本信息

批准号：
14011238
负责人：
村田正治
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

ゲノム解析により多くのタンパクをコードする遺伝子が解明されつつあるが、今後は未知のタンパクの機能や変異が生命システムに及ぼす影響を迅速かつ簡便に評価することが必要になる。本研究では、多くのタンパクを基板上に固定化し、一度に評価できるシステムの開発を目指した。まず、代表的な核内転写因子であり、内分泌撹乱物質の標的タンパク質としても知られているヒトエストロゲンレセプター(hER)を固定化した電気化学素子の開発を行った。遺伝子組み換え技術によってN末端にヒスチジンタグを導入したhERリガンド結合ドメイン(hER-LBD)を大量合成した。これを末端チオール化ニトリロトリ酢酸(NTA)誘導体と金属イオンを介して結合、さらに金-チオール間の化学吸着現象を利用することによって、hER-LBD三元複合体を金薄膜上へ固定化した。レセプタータンパク質の最も重要な機能がタンパク質-タンパク質間相互作用である。そこで我々は固体電極上に固定化したレセプターのリガンド誘導的なタンパク質複合体の形成を水晶振動子(QCM)法によって観察することを試みた。hER-LBD固定化電極を測定溶液に浸積し、これに所定の濃度の天然女性ホルモン17β-エストラジオールとhERのコアクチベーターSRC-1を加えたところ17β-エストラジオール依存的に水晶振動子の重量増加が観察された。これは振動子上に固定化されたhER-LBDがリガンド結合によってコンホメーション変化しSRC-1と複合体を形成したためである。周波数変化から換算すると、水晶振動子上に固定化された5pmolのhER-LBDに、10nMという極めて低濃度の17β-エストラジオールを作用させたところ、およそ1.8pmolのSRC-1が結合したことが明らかとなった。QCM法はラベル化反応等の煩雑な操作が不要であり、タンパク質間相互作用の新しいツールとして有効である。

基因组分析开始揭示编码许多蛋白质的基因，但是有必要快速，轻松地评估未来未知蛋白功能和突变对生命系统的影响。在这项研究中，我们旨在开发一种系统，该系统允许将许多蛋白质固定在基板上并立即进行评估。首先，我们开发了一种电化学装置，该装置固定了人类雌激素受体（HER），这是一种典型的核转录因子，也称为内分泌干扰物的靶蛋白。她的大量配体结合结构域（HER-LBD）通过转基因技术与N末端引入的组氨酸标签合成。这与通过金属离子的末端硫醇二乙酸（NTA）衍生物结合，并通过利用金硫醇化学吸收现象，将HER-LBD三元络合物固定在金薄膜上。受体蛋白最重要的功能是蛋白质 - 蛋白质相互作用。因此，我们试图观察通过石英（QCM）方法固定在固体电极上的配体诱导的受体的蛋白质复合物的形成。将HER-LBD固定电极浸入测量溶液中，并将天然雌激素17β-雌二醇和HER共激活剂SRC-1添加到溶液中，并观察到17β-雌二醇依赖性的重量增加。这是因为固定在传感器上的HER-LBD通过配体结合以与SRC-1形成复合物构象相吻合。当从频率变化转换时，揭示了以极低浓度为10 nm处的17β-雌二醇将固定在石英晶体上的5 pmol Her-LBD应用于5 pmol HER-LBD，大约1.8 pmol的SRC-1结合了。 QCM方法不需要复杂的操作，例如标记反应，并且可以作为蛋白质蛋白质相互作用的新工具有效。