副腎中で発現しているMDRcDNAの単離とMDR蛋白の大腸菌中での生産

肾上腺表达的 MDR cDNA 的分离以及大肠杆菌中 MDR 蛋白的产生

基本信息

批准号：
63560083
负责人：
植田和光
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1988
资助国家：
日本
起止时间：
1988 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

癌の多剤耐性に関係しているMDR1遺伝子は、ヒトの肝臓、腎臓、大腸、副腎などで発現している。MDR1遺伝子のコードするP-糖蛋白質は、本来食物中の有害物などを体外に排出していると考えられる。副腎においては、発現様式が他の器官と異なるため、それ以外の機能が考えられた。P-糖蛋白質の副腎における本来の機能を解明する事を目的に、本年は次の事を行った。1.ヒト正常副腎RNAを用いてcDNAライブラリーを作成し、4.2kbのMDR1cDNAを単離した。全塩基配列を決定した結果、副腎MDR1cDNAは、すでに多剤耐性細胞から単離していたcDNAと比べ9塩基の置換を持っており、185番目と893番目のアミノ酸が異なっていた。2.各器官及び培養細胞のRNAとDNAを検討した結果、185番目のアミノ酸置換は、コルヒチン選別多剤耐性細胞でのみ見いだされ、893番目のアミノ酸は、ヒトゲノム中で多型性を示すことが示唆された。3.2つのアミノ酸置換を種々組換えた4種のcDNAを発現ベクターにつなぎ、マウス培養細胞に導入した。いずれのcDNAも培養細胞を、コルヒチン、ビンブラスチン、アドリアマイシンに対して同時に耐性にした。さらに185番目のアミノ酸の違いが、これらの薬剤に対する相対耐性度を大きく変化させることが明らかになった。4.ヒトMDR1遺伝子を酵母内で誘導発現する系を確立した。発現させたPー糖蛋白質が、酵母細胞膜に正しい方向に挿入されていることが抗体によって確認できた。Pー糖蛋白質は、酵母細胞膜の数パーセントに達し、試験管内で薬剤結合活性を示した。以上の系を用い、副腎におけるステロイドホルモン輸送などへのPー糖蛋白質の関与などを、さらに解明したい。

MDR1 基因与癌症的多药耐药性相关，在人类肝脏、肾脏、大肠和肾上腺中表达。 MDR1基因编码的P-糖蛋白被认为最初是将食物中的有害物质从体内排出。由于肾上腺的表达模式与其他器官不同，因此考虑了其他功能。今年，我们进行了以下活动，旨在阐明肾上腺中P-糖蛋白的原始功能。 1.利用人正常肾上腺RNA构建cDNA文库，分离出4.2kb的MDR1 cDNA。确定整个碱基序列的结果是，与已经从多重耐药细胞中分离的cDNA相比，肾上腺MDR1 cDNA有9个碱基替换，并且第185和893位的氨基酸不同。 2.检查各器官和培养细胞的RNA和DNA的结果，仅在秋水仙碱选择的多重耐药细胞中发现第185位的氨基酸取代，并且发现第893位的氨基酸取代是多态性的在人类基因组中提出。 3.将具有不同两个氨基酸取代的四种cDNA连接至表达载体并引入培养的小鼠细胞中。两种 cDNA 同时使培养的细胞对秋水仙碱、长春花碱和阿霉素产生抗性。此外，还发现185位氨基酸的差异显着改变了对这些药物的相对耐药性。 4.我们建立了在酵母中诱导表达人类MDR1基因的系统。使用抗体，证实表达的P-糖蛋白以正确的方向插入酵母细胞膜。 P-糖蛋白到达酵母细胞膜的百分之几，并在体外显示出药物结合活性。利用上述系统，我们希望进一步阐明P-糖蛋白在肾上腺类固醇激素转运中的参与。