遺伝子改変による多剤耐性を担うMDR蛋白の機能と解析と耐性克服への応用

通过基因改造导致多药耐药的MDR蛋白的功能和分析以及克服耐药性的应用

基本信息

批准号：
01015052
负责人：
植田和光
金额：
$ 1.66万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Cancer Research
财政年份：
1989
资助国家：
日本
起止时间：
1989 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

ヒトMDR1遺伝子は、培養細胞の多剤耐性を担っているだけでなく、腎臓癌などにおける自然耐性や獲得性多剤耐性に関係していることが解明されつつある。耐性を克服するためには、この現象へのMDRI遺伝子の関与をさらに明らかにするとともに、MDR1遺伝子のコードするPー糖蛋白質の機能を解明すること、MDR1遺伝子の発現制御機構を解明することが必要である。そのために本年度は次のことを行なった。1.種々の欠失および挿入変異によって改変したMDR1遺伝子を、ヒト、マウス培養細胞で発現させた。C末端20アミノ酸を欠失させると細胞を耐性にする活性が非常に減少した。また前半半分だけあるいは後半半分だけでもPー糖蛋白質は機能しなかった。Pー糖蛋白質が薬剤運搬ポンプとして機能するためには分子内重複をした完全な構造が必要であることが示唆された。2.前半後半それぞれ半分を酵母内で発現させた結果、アジドピンは主に後半に結合する基礎的結果を得た。3.ヒト副腎より新たに単離したPー糖蛋白質cDNAは、コルヒチン選別多剤耐性細胞から単離したcDNAと比べて2つのアミノ酸置換を持っていた。前半に位置する185番のアミノ酸置換は、コルヒチンに対する耐性度を大きく変化させた。この部位が薬剤認識に関与していることが示唆された。4.さらに機能の解明を進めるため、MDR1遺伝子とbetaーガラクトシダーゼ遺伝子を融合させ酵母内で誘導発現させることによって種々の改変Pー糖蛋白質精製を試みた。5.ヒト正常組織から発現制御部位を単離し構造解析した結果、ストレス誘導遺伝子に存在する配列が存在することがわかった。この配列の役割およびMDR1遺伝子の発現制御の解析を進めている。

越来越清楚的是，人类MDR1基因不仅负责培养细胞的多药耐药性，而且还参与肾癌和其他疾病的自然耐药性和获得性多药耐药性。为了克服耐药性，有必要进一步阐明MDR1基因在此现象中的参与，阐明MDR1基因编码的P-糖蛋白的功能，阐明MDR1基因的表达控制机制。为此，今年我们做了以下工作： 1.经过各种缺失和插入突变修饰的MDR1基因在培养的人和小鼠细胞中表达。 C端20个氨基酸的缺失大大降低了细胞产生耐药性的活性。此外，P-糖蛋白仅在前半部分或后半部分不发挥作用。这些结果表明，P-糖蛋白需要具有分子内重复的完整结构才能发挥药物转运泵的作用。 2.通过在酵母中表达前半部分的各部分，我们得到了叠氮平主要与后半部分结合的基本结果。 3. 与从秋水仙碱选择的多重耐药细胞中分离的 cDNA 相比，从人肾上腺中新鲜分离的 P-糖蛋白 cDNA 有两个氨基酸取代。位于前半部分的185位氨基酸取代显着改变了对秋水仙碱的抗性程度。有人认为该区域参与药物识别。 4.为了进一步阐明它们的功能，我们尝试通过融合MDR1基因和β-半乳糖苷酶基因并在酵母中诱导表达来纯化各种修饰的P-糖蛋白。 5.对正常人体组织的表达控制位点进行分离和结构分析的结果，发现存在应激诱导基因中存在的序列。我们目前正在分析该序列的作用以及MDR1基因表达的调控。