遺伝子改変による多剤耐性を担うヒトMDR蛋白の機能の解析

通过基因改造分析人类多重耐药蛋白的功能

基本信息

批准号：
63015045
负责人：
植田和光
金额：
$ 1.54万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Cancer Research
财政年份：
1988
资助国家：
日本
起止时间：
1988 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

癌の薬剤耐性にMDR1遺伝子が関与していることが示唆されている。薬剤耐性を克服するためには、この現象へのMDR1遺伝子の関与を明らかにし、MDR1遺伝子のコードするP-糖蛋白質の機能を解明する事が必要である。そのために、本年は次の事を行った。1.ヒト正常組織の遺伝子ライブラリーから、MDR1遺伝子のプロモーター部位を単離した。この領域を用いて、MDR1遺伝子発現量の感度の高い検出系を確立した。その結果、腎臓や大腸由来の多くの癌でMDR1遺伝子の高い発現を認めた。これらの癌の薬剤低感受性へのP-糖蛋白質の関与が示唆された。2.部位特異的変異導入や組換え技術を用いて改変したMDR1遺伝子を、ヒト、マウス培養細胞内で発現させる系を確立した。その結果、C末端20アミノ酸が耐性発現に重要である結果を得た。3.ヒトMDR1遺伝子を酵母内で誘導発現する系を確立した。発現させたP-糖蛋白質が、酵母細胞膜に正しい方向に挿入されていることが抗体によって確認できた。P-糖蛋白質は、酵母細胞膜の数パーセントに達し、試験管内で薬剤結合活性を示した。この系は、薬剤結合部位の固定やP-糖蛋白質の大量精製に有効と思える。4.P-糖蛋白質は、副腎・肝臓などで本来発現している。正常機能を解明することは、P-糖蛋白質の機能を阻害したときの副作用を予見する上でも重要であり。申請者は、ヒト正常副腎から新たにMDR1cDNAを単離し、構造解析した。その結果、多剤耐性培養細胞から単離したP-糖蛋白質との間に2アミノ酸の違いを発見した。アミノ酸置換の一つは導入した細胞の相対薬剤耐性度を大きく変化させた。今後以上の系を用い、P-糖蛋白質の薬剤結合部位など機能部位の解析及び活性阻害剤検索系の確立、転写制御機構の解明を行いたい。

有人认为MDR1基因与癌症耐药性有关。为了克服耐药性，有必要阐明MDR1基因在这一现象中的参与，并阐明MDR1基因编码的P-糖蛋白的功能。为此，我们今年做了以下工作： 1.从人类正常组织基因库中分离出MDR1基因的启动子区。利用该区域，我们建立了高灵敏度的 MDR1 基因表达检测系统。结果，在许多源自肾脏和结肠的癌症中发现了 MDR1 基因的高表达。有人提出 P-糖蛋白参与这些癌症的药物敏感性。 2.我们建立了一个在培养的人和小鼠细胞中表达MDR1基因的系统，该系统使用定点诱变和重组技术进行修饰。结果，我们发现C端20个氨基酸对于耐药性的产生很重要。 3.我们建立了在酵母中诱导表达人类MDR1基因的系统。使用抗体，证实表达的P-糖蛋白以正确的方向插入酵母细胞膜。 P-糖蛋白到达酵母细胞膜的百分之几，并在体外显示出药物结合活性。该系统似乎对于固定药物结合位点和大规模纯化 P-糖蛋白是有效的。 4.P-糖蛋白在肾上腺和肝脏中天然表达。阐明正常功能对于预测 P-糖蛋白功能受到抑制时的副作用也很重要。申请人新从正常人肾上腺中分离出MDR1 cDNA，并分析了其结构。结果，他们发现了该蛋白与从多重耐药培养细胞中分离出的 P-糖蛋白之间存在两个氨基酸差异。其中一种氨基酸取代显着改变了引入细胞的相对耐药性。未来，我们希望利用上述系统来分析P-糖蛋白的药物结合位点等功能位点，建立寻找活性抑制剂的系统，并阐明转录控制机制。