新規浸潤・転移阻止因子NK4による血管新生阻害機構の解明と膵癌治療への応用

新型侵袭/转移抑制因子NK4抑制血管生成机制的阐明及其在胰腺癌治疗中的应用

基本信息

批准号：
01J00560
负责人：
久場敬司
金额：
$ 1.54万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2003
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-01J00560/
关键词：
血管新生膵癌肝細胞増殖因子(HGF)NK4 浸潤・転移クリングル

项目摘要

本年度は,NK4による血管新生阻害作用に関与する内皮細胞のNK4結合分子を同定した。方法としては、リコンビナントNK4を固相化したビーズを用いる生化学的な手法を試みた。具体的には、細胞膜表面をビオチン化した内皮細胞の抽出物を調製し、NK4ビーズと反応させてpull down assayを行った。その結果、ビオチン化された分子量38kDの分子(p38)が再現性良くNK4ビーズに結合し、0.5M NaClで溶出された。一方で、線維芽細胞の抽出物を用いた場合には、ビオチン化p38は全く認められなかった。したがって、p38はNK4とイオン結合を介して結合していて、さらにその結合は内皮細胞特異的であることがわかった。そこで、p38蛋白のアミノ酸配列を決定するために、内皮細胞の抽出物を大量に準備し、大量にp38を調製した。調製したp38をSDS-PAGEで分離し、p38のバンドを切り出し、LC-MS/MS分析を行ったところ、p38は主に核内に存在する既知のリン酸化蛋白であることがわかった。しかしながら、p38に対する特異的抗体を用いて行った解析の結果、p38はビオチン化されていて、かつ内皮細胞特異的にNK4に結合することが確認された。したがって、p38がNK4の血管新生阻害活性に関与している可能性が強く示唆された。

今年，确定了参与NK4血管新生命抑制作用的内皮细胞的NK4结合分子。作为一种方法，我们使用固化重组NK4的珠尝试了生化方法。具体而言，制备了由生物素化细胞膜表面制成的内皮细胞提取物，并与NK4珠反应。结果，具有生物素化分子量（p38）的38KD（p38）的分子与具有良好可重复性的NK4珠结合，并由0.5m naCl洗脱。另一方面，当使用纤维发芽提取物时，未识别生物素p38。因此，发现p38通过离子键通过NK4键合，其键特异于内皮细胞。因此，为了确定p38蛋白的氨基酸序列，制备了大量的内皮细胞提取物，并制备了大量的p38。将制备的p38与SDS-PAGE分离，切出p38带，而LC-MS/MS分析表明，p38主要在细胞核中已知。但是，由于使用p38的特定抗体进行了分析，因此可以证实p38被生物素化并通过内皮细胞专门与NK4结合。因此，强烈建议p38参与NK4血管抑制活性。