Haーrasによって誘導されるエンハンサー結合因子の遺伝子クローニングと機能解析

Haras诱导的增强子结合因子基因克隆及功能分析

基本信息

批准号：
01015041
负责人：
重定勝哉
金额：
$ 3.65万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Cancer Research
财政年份：
1989
资助国家：
日本
起止时间：
1989 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

我々は、先にポリオーマウイルスエンハンサー中のAエレメントに結合する細胞性因子PEBP2を同定し、その分子的性状がHaーrasによるトランスフォーメーションに際して劇的に変化することを見いだした。そこで本研究ではPEBP2の機能と役割をさらに追究するために本因子の分子的特性解析とcDNAクローニングを次の如く進めた。まずトランスフォーム細胞をヌードマウスに移植して作らせた癌組織を出発材料とし、DNAアフィニティークロマトグラフィーを主体とする方法によりPEBP2の精製を行った。数百匹分の材料を処理することにより、総計数十マイクログラムの純化標品を得ることが出来た。これを用いてアミノ酸配列の決定を行い2ー3の部分配列を得た。この情報を基に現在cDNAクローニングを遂行中である。他方、分子的解析の結果、PEBP3は(i)2種類のサブユニットalphaとbeta(分子量30ー35Kおよび20ー25K)からなるヘテロダイマーである、(ii)alphaとbetaは共にDNA結合活性を持ち、しかもその認識配列は全く同等である。(iii)PEBP2は全体として2価のDNA結合能を持ち、DNAにループ構造を形成させる働きがあるなど種々の特徴的性質を持つことが判った。これらの知見に加えて,PEBP3はポリオーマウイルスエンハンサー上の中心的機能領域であるAおよびBエレメントの双方にほぼ同じ強さで特異的に結合することが見いだされ、同因子がポリオーマウイルスの転写・複製の制御にとって従来予想された以上に重要な役割を果している可能性が示唆された。さらに細胞遺伝子上での役割に関する有力な手がかりとして、発癌遺伝子cーmycの上流域に存在するDNA複製開始信号配列にPEBP3が結合することが見いだされた。

我们之前鉴定了 PEBP2，一种与多瘤病毒增强子中的 A 元件结合的细胞因子，并发现其分子特性在 Haras 转化后发生巨大变化。因此，在本研究中，为了进一步研究PEBP2的功能和作用，我们对该因子进行了如下的分子表征和cDNA克隆。首先，以将转化细胞移植到裸鼠体内而产生的癌组织为起始材料，使用主要基于DNA亲和层析的方法纯化PEBP2。通过处理数百只动物的材料，我们总共获得了数十微克的纯化样本。利用它，我们确定了氨基酸序列并获得了2-3个部分序列。基于这一信息，cDNA 克隆目前正在进行中。另一方面，分子分析结果表明，PEBP3是（i）由α和β两个亚基（分子量30-35K和20-25K）组成的异二聚体，并且（ii）α和β都具有DNA-而且，它们的识别序列完全相同。 (iii) PEBP2被发现具有各种特性，包括结合二价DNA作为整体并在DNA中形成环结构的能力。除了这些发现之外，还发现 PEBP3 与 A 和 B 元件（多瘤病毒增强子的中心功能区）特异性结合，强度大致相同，表明 PEBP3 与 A 和 B 元件特异性结合，这表明 PEBP3 与 A 和 B 元件特异性结合。是多瘤病毒增强子的中心功能区，有人认为该蛋白在调节转录和复制方面可能发挥比之前预期更重要的作用。此外，还发现 PEBP3 与位于癌基因 cmyc 上游的 DNA 复制起始信号序列结合，为了解其在细胞基因中的作用提供了有力的线索。