細胞機能の発現を制御し解析するための遺伝子操作技術の開発

开发基因操作技术来控制和分析细胞功能的表达

基本信息

批准号：
12878126
负责人：
石渡信一
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Waseda University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

Caged遺伝子の合成:Caged mRNAを作成するために、Caged DNAの調製を試みてきた。Cagedのための一つの方策として、DNA塩基のアミノ基をDMNBB(4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl bromide)で化学修飾し、DNAの複製機能を一旦失活させ、それを紫外線照射によって再活性化する、という方針で不活性化DNAの合成を試みた。一時はPCR法によって確認できたと思われたが、再現性に問題があり、結局DNA塩基のアミノが化学修飾に対して活性が高くない、という結論に達した。この間、Caged遺伝子を調製したという報告が数編発表される状況になったので、我々は方針を転換し、目的の研究課題の鍵となる、新しいタイプのDNAチップや細胞操作開発、それに、細胞機能解析のための新手法の開発に力を入れることとした。遺伝子の固定化と選択的回収技術:昨年度までの研究を進め、Cr基盤上へのDNA固定化法と、赤外レーザー照射による選択的な回収法を確立し、その方法の詳細を論文として公表した。GFP-アクチンの心筋培養細胞内発現:ニワトリの未分化筋芽細胞・マウス筋芽細胞株C2C12へ、蛍光タンパク質GFPをfusionしたアクチンのプラスミドを導入すること、そしてその未分化細胞を筋管へと分化させることを試みた。その過程でGFP-アクチンがどのように細胞骨格や筋原線維収縮系に組み込まれていくかを、共焦点蛍光顕微鏡を用いて解析している。アクチンフィラメントをストレスセンサーとして用いることの試み:GFP-アクチンを用いて、アクチンフィラメントに加わる張力を蛍光画像化するための方法を開発しようと、幾つかの試みをした。アクチンフィラメントをストレスセンサーとして用いることが出来れば、その細胞機能解析への応用は計り知れないものがある。

Cged基因的合成：为了创建Cged mRNA，我们尝试制备Cged DNA。作为Cged的一种策略，我们尝试用DMNBB（4,5-二甲氧基-2-硝基苄基溴）对DNA碱基的氨基进行化学修饰，暂时使DNA复制功能失活，然后通过紫外线照射将其重新激活。 DNA 的目的是使 DNA 失活。一度认为可以用PCR方法来证实这一点，但存在重现性问题，最终得出的结论是DNA碱基中的氨基酸对于化学修饰的活性并不高。在此期间，发表了几篇关于Cged基因制备的报告，因此我们改变了策略，决定开发新型DNA芯片、细胞操作和细胞工程，这将是我们研究课题的关键。专注于开发泛函分析的新方法。基因固定和选择性恢复技术：我们截至去年已经进行了研究，建立了在Cr基底上的DNA固定方法和利用红外激光照射的选择性恢复方法，并在论文中发表了该方法的细节。培养心肌细胞中GFP-肌动蛋白的表达：将与荧光蛋白GFP融合的肌动蛋白质粒引入未分化的鸡成肌细胞和小鼠成肌细胞系C2C12中，并将未分化的细胞转化为肌管，并尝试将其分化。使用共焦荧光显微镜，我们正在分析 GFP-肌动蛋白在此过程中如何融入细胞骨架和肌原纤维收缩系统。尝试使用肌动蛋白丝作为压力传感器：进行了多次尝试来开发一种使用 GFP-肌动蛋白对肌动蛋白丝施加的张力进行荧光成像的方法。如果肌动蛋白丝可以用作压力传感器，那么它们在细胞功能分析中的应用是不可估量的。