タンパク質線維状重合体を用いた生体ナノゲージの開発と応用

蛋白质纤维聚合物生物纳米测量仪的开发与应用

基本信息

批准号：
13559008
负责人：
石渡信一
金额：
$ 9.66万
依托单位：
Waseda University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

タンパク質線維状重合体として、アクチンフィラメントと微小管を取り上げ、これらの機能(ミオシンやキネシンなどの分子モーターの運動性への寄与)を解折するとともに、"生体ナノゲージ"として細胞生物学研究に利用することを企てている。その第一歩として、蛍光色素をラベルしたアクチン分子をアクチンフィラメントに組み込み、フィラメントの状態を蛍光画像化しモニターすることを試みている。1)蛍光タンパク質GFPをfusionしたアクチンのプラスミドを、ニワトリの未分化筋芽細胞・マウス筋芽細胞株C2C12に導入し、その未分化細胞を筋管へと分化させることを試みた。まず、アクチン分子のN末端とC末端にそれぞれGFPを導入し培養心筋細胞に発現させたところ、細胞は正常に発達し、GFPアクチンはフィラメントに組み込まれた(共焦点蛍光顕微鏡により観察)。つぎに、アクチン分子を2つの部分に分割し、そこに、前後を入れ替えたGFPを導入した。こうすることによってGFPの構造を不安定化し、アクチン分子に加わる力によって生じる分子歪みに応じてGFPの蛍光性が変化することを期待した。これまで、分割する場所を2箇所検討したが、両方ともに大量発現させると、細胞は正常には発達しないことが分かった。現在、別の部位へのGFPの導入や、変異アクチンの発現量の制御、別タイプのGFP導入アクチンの調製を行っている。2)アクチン分子のCys374を蛍光ラベルし、これをフィラメントに導入することによってフィラメントの状態をモニターすることを試みた。ローダミンを導入するとミオシン分子モーターの運動性(運動速度、ATPase活性)が導入率に応じて減少することを見出した。今後は、フィラメントに負荷を加えることによる蛍光強度や蛍光スペクトルの変化、モーター機能への影響を、1本のフィラメントのレベルで検討したい。

我计划将肌动蛋白丝和微管作为蛋白质纤维聚合物，剖析它们的功能（对肌球蛋白和驱动蛋白等分子马达运动的贡献），并将它们用作细胞生物学研究的“生物纳米计量器”。作为第一步，我们尝试将荧光染料标记的肌动蛋白分子整合到肌动蛋白丝中，并使用荧光成像监测丝的状态。 1）我们将与荧光蛋白GFP融合的肌动蛋白质粒导入鸡未分化成肌细胞和小鼠成肌细胞系C2C12中，并尝试将未分化细胞分化为肌管。首先，当我们将GFP引入肌动蛋白分子的N端和C端并在培养的心肌细胞中表达时，细胞正常发育，并且GFP-肌动蛋白被掺入丝中（使用共聚焦荧光显微镜观察）。接下来，他们将肌动蛋白分子分成两部分，并将反向 GFP 引入其中。通过这样做，他们破坏了 GFP 结构的稳定性，并预计 GFP 的荧光会因施加于肌动蛋白分子的力而引起的分子变形而发生变化。到目前为止，我们已经研究了两个分裂位置，但发现如果两个位置都大量表达，细胞就无法正常发育。目前，我们正在将GFP引入到不同的位点，控制突变肌动蛋白的表达水平，并制备另一种引入GFP的肌动蛋白。 2）我们尝试通过荧光标记肌动蛋白分子的Cys374并将其引入丝状体来监测丝状体的状态。我们发现，当引入罗丹明时，肌球蛋白分子马达的运动性（动速度、ATP酶活性）根据引入速率而降低。将来，我们希望在单根灯丝水平上检查由于灯丝负载增加而导致的荧光强度和荧光光谱的变化，以及对运动功能的影响。