タンパク質間相互作用の一分子くり返し計測

蛋白质-蛋白质相互作用的重复单分子测量

基本信息

批准号：
08458213
负责人：
石渡信一
金额：
$ 4.61万
依托单位：
Waseda University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至 1997
项目状态：
已结题

项目摘要

(1)アクチンフィラメントの後端に結合した直径1μmのポリスチレンビーズを、レーザー光ピンセットによって顕微操作し、アクチンフィラメントとアクチン結合性タンパク質との間の分子間結合に負荷を加え、結合の破断力などを繰り返し顕微計測することができる方法を、この数年間で我々は確立した。この方法を、アクチンフィラメントとスペクトリン(赤血球の裏打ちタンパク質の一種)との1分子結合(破断)力の計測に応用した。その結果、予備的実験ではあるが、結合の破断力として、平均3pNという値が得られた。これは、アクチンフィラメントとミオシン間の硬直結合力(平均9pN)や、α-アクチニンとの結合力(平均15pN)と比べて有意に小さい。(2)アクチンフィラメントとミオシン(HMM)分子間の硬直結合の破断力の測定については、単頭のHMMを調製して双頭のHMMと比較した。その結果、単頭HMMの破断力の分布は約7pNにピークを持つのに対して、双頭HMMでは数pNから20pNにわたる広い分布を示した。(7pNと10数pNとに2つのピークをもつ)。このことから、アクチンとHMM分子との結合力は、単頭と双頭とで約2倍異なることが示唆された。(3)アクチン分子を、蛋白分解酵素Subtilisinで処理すると、アクチンSubdomain2が2カ所で限定分解される(質量分析とペプチドシークエンサーによって切断箇所を同定した)が、そのことによって、HMM分子による滑り速度と滑り力が約20%に減少した。ところが、硬直結合の破断力は70%程度にしか低下しなかった。このことから、アクチンのsubdomain2は、ATP存在下での滑り機能に重要な役割を演じているが、ATP非存在下での硬直結合にはそれほど関与していないことが推論された。

(1)使用激光镊子对肌动蛋白丝后端结合的直径为1μm的聚苯乙烯珠进行显微操作，对肌动蛋白丝和肌动蛋白结合蛋白之间的分子间键施加载荷，并观察断裂力在过去的几年里，我们建立了一种可以重复进行显微测量的方法。该方法用于测量肌动蛋白丝和血影蛋白（一种红细胞内衬蛋白）之间的单分子结合（断裂）力。结果，尽管这是初步实验，但获得了3pN的平均键断裂力。这明显小于肌动蛋白丝和肌球蛋白之间的刚性结合力（平均 9 pN）以及与 α-肌动蛋白的结合力（平均 15 pN）。 (2)为了测量肌动蛋白丝和肌球蛋白(HMM)分子之间刚性键的断裂力，我们制备了单头HMM并将其与双头HMM进行了比较。结果，单头HMM的断裂力分布在约7pN处有峰值，而双头HMM则呈现出从几个pN到20pN的宽分布。（在 7 pN 和 10 多 pN 处有两个峰）。这表明肌动蛋白和 HMM 分子之间的结合强度在单头分子和双头分子之间大约相差两倍。 (3)当肌动蛋白分子用蛋白水解酶枯草杆菌蛋白酶处理时，肌动蛋白Subdomain2在两个位置被有限地降解(利用质谱和肽测序仪鉴定了切割位置)；滑动力降低至约20%。然而，刚性结合的断裂力仅降低了约70%。由此推断，肌动蛋白的亚结构域2在ATP存在的情况下在滑动功能中发挥重要作用，但在ATP不存在的情况下不显着参与刚性结合。