一分子と集合体レベルでの分子モーター機能の顕微解析

单分子和聚集水平分子运动功能的微观分析

基本信息

批准号：
10175220
负责人：
石渡信一
金额：
$ 1.73万
依托单位：
Waseda University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

分子モーター機能を、以下の実験系について解析した。1)アクチン・ミオシン分子モーター系:アクチン・ミオシン(HMM)分子間の硬直結合状態における破断力分布を、様々な負荷上昇速度のもとで計測した。その結果、負荷上昇速度が大きいと、破断力分布は7pN付近と15pN付近に2つのピークをもつが、負荷上昇速度が小さくなると、15pN付近のピークが消えることが分かった。このことから、硬直状態においてミオシン分子は単頭・双頭結合の平衡状態にあると結論された。ATP存在下でのHMM分子の発生張力を、in vitro滑り運動系で1分子計測し、温度やATPアナログの作用を検討した。その結果、発生張力は温度にほとんど依存しないこと、ATPに比べてGTPでの発生張力は約半分であること、などが分かった。2)微小管・キネシン分子モーター系:微小管・キネシン分子間結合の破断力と、キネシン分子の弾性率を、ATP非存在下(硬直状態)とAMPPNP存在下(ATP状態)で計測した。そこで1)と同様に、破断力と弾性率の負荷上昇速度依存性を計測した。その結果、破断力、弾性率ともに、硬直状態ではATP状態の約半分であることから、前者では単頭結合、後者では主に双頭結合であると結論された。さらに負荷上昇速度依存性から、双頭・単頭結合間に平衡関係が成り立っていることが分かり、そこでの速度定数が見積もられた。3)心筋収縮系:最大等尺張力に対するpHの作用は、心筋と骨格筋では異なる。アクチンフィラメント再構成心筋を用いて張力のpH依存性を調べたところ、制御タンパク質を含まないアクチンフィラメント再構成筋が最もpHの影響を受けやすいことが分かった。そこで心筋、骨格筋から調製したトロポミオシン、トロポニンを用いて、制御タンパク質をも再構成して調べたところ、pH減少に伴う張力減少の程度がトロポミオシンによって制御されることが明らかになった。

在以下实验系统中分析分子运动功能。 1）肌动蛋白-肌球蛋白分子运动系统：在不同的负载增加率下测量肌动蛋白-肌球蛋白（HMM）分子之间刚性键的断裂力分布。结果发现，当载荷增加率较高时，断裂力分布在7pN和15pN附近有两个峰值，但当载荷增加率减小时，15pN附近的峰值消失。由此得出结论，在刚性状态下，肌球蛋白分子处于单头键和双头键的平衡状态。使用体外滑动系统测量单个分子在 ATP 存在下 HMM 分子产生的张力，并研究温度和 ATP 类似物的影响。结果，我们发现产生的张力几乎与温度无关，并且GTP产生的张力约为ATP的一半。 2）微管/驱动蛋白分子运动系统：在不存在ATP（刚性态）和存在AMPPNP（ATP态）的情况下测量微管与驱动蛋白分子之间键的断裂力和驱动蛋白分子的弹性模量。因此，与1)类似，我们测量了断裂力和弹性模量对负载增加率的依赖性。结果，由于刚性状态下的断裂力和弹性模量约为ATP状态下的一半，因此可以得出前者为单头键，而后者主要为双头键。此外，从负载增加率依赖性发现双头连接和单头连接之间存在平衡关系，并估计其中的速率常数。 3) 心肌收缩系统：pH值对最大等长张力的影响在心肌和骨骼肌中是不同的。当我们使用肌动蛋白丝重建心肌研究张力的 pH 依赖性时，我们发现肌动蛋白丝重建肌肉不含调节蛋白，最容易受到 pH 值的影响。使用从心肌和骨骼肌中制备的原肌球蛋白和肌钙蛋白，我们重建并检查了调节蛋白，发现与pH降低相关的张力降低程度是由原肌球蛋白调节的。