一分子と集合体レベルでの分子モーター機能の顕微解析

单分子和聚集水平分子运动功能的微观分析

基本信息

批准号：
10175220
负责人：
石渡信一
金额：
$ 1.73万
依托单位：
Waseda University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

分子モーター機能を、以下の実験系について解析した。1)アクチン・ミオシン分子モーター系:アクチン・ミオシン(HMM)分子間の硬直結合状態における破断力分布を、様々な負荷上昇速度のもとで計測した。その結果、負荷上昇速度が大きいと、破断力分布は7pN付近と15pN付近に2つのピークをもつが、負荷上昇速度が小さくなると、15pN付近のピークが消えることが分かった。このことから、硬直状態においてミオシン分子は単頭・双頭結合の平衡状態にあると結論された。ATP存在下でのHMM分子の発生張力を、in vitro滑り運動系で1分子計測し、温度やATPアナログの作用を検討した。その結果、発生張力は温度にほとんど依存しないこと、ATPに比べてGTPでの発生張力は約半分であること、などが分かった。2)微小管・キネシン分子モーター系:微小管・キネシン分子間結合の破断力と、キネシン分子の弾性率を、ATP非存在下(硬直状態)とAMPPNP存在下(ATP状態)で計測した。そこで1)と同様に、破断力と弾性率の負荷上昇速度依存性を計測した。その結果、破断力、弾性率ともに、硬直状態ではATP状態の約半分であることから、前者では単頭結合、後者では主に双頭結合であると結論された。さらに負荷上昇速度依存性から、双頭・単頭結合間に平衡関係が成り立っていることが分かり、そこでの速度定数が見積もられた。3)心筋収縮系:最大等尺張力に対するpHの作用は、心筋と骨格筋では異なる。アクチンフィラメント再構成心筋を用いて張力のpH依存性を調べたところ、制御タンパク質を含まないアクチンフィラメント再構成筋が最もpHの影響を受けやすいことが分かった。そこで心筋、骨格筋から調製したトロポミオシン、トロポニンを用いて、制御タンパク質をも再構成して調べたところ、pH減少に伴う張力減少の程度がトロポミオシンによって制御されることが明らかになった。

分子运动功能分析了以下实验系统：1）肌动蛋白 - 肌球蛋白分子运动系统：在各种负载增加速率下测量肌动蛋白 - 肌球蛋白（HMM）分子之间刚性键态的断裂力分布。结果，发现当载荷增加速率较大时，破裂力分布在7pn和15pn左右的峰值有两个峰，但是当载荷增加速率很小时，峰值左右就会消失。这得出的结论是，肌球蛋白分子处于刚性状态的单头和双头键平衡状态。在体外的滑动运动系统中测量了在ATP存在下产生的HMM分子的张力，并研究了ATP类似物的温度和效果。结果，发现生成的张力几乎不取决于温度，并且与ATP相比，GTP的产生张力约为一半。 2）微管/驱动蛋白分子运动系统：在不存在ATP（刚性状态）和AMPPNP（ATP状态）的情况下测量了分子间微管/驱动蛋白键的破裂力和驱动蛋白分子的弹性模量。因此，以与1）相同的方式，测量破裂力和弹性模量对载荷增加速率的依赖性。结果，破裂力和弹性模量大约是刚性状态的ATP状态的一半，得出的结论是，前者是单头键，后者主要是双头键。此外，负载增加速率的依赖性表明，双头和单头耦合连接之间存在平衡关系，并且估计那里的速率常数。 3）心肌收缩系统：pH对心肌和骨骼肌之间最大等距张力的影响。当使用肌动蛋白细丝重建心肌检查张力的pH依赖性时，发现肌动蛋白丝重建不包含调节蛋白的肌肉最容易受到pH的影响。因此，当我们使用从心肌和骨骼肌制备的肌动蛋白和肌钙蛋白重新结构调节蛋白时，我们发现与pH下降相关的张力减少程度由pH肌动蛋白控制。