プロテインダイナミクスのプロテオーム解析に関する基礎的研究

蛋白质动力学蛋白质组分析基础研究

基本信息

批准号：
12206073
负责人：
榊原陽一
金额：
--
依托单位：
University of Miyazaki
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

細胞のシグナル応答によって誘導されるタンパク質のダイナミックな挙動を個々のタンパク質に的を絞らず、プロテオーム解析により網羅的に解析できる分析方法の確立を目的とし、そのための細胞分画条件、二次元電気泳動による分離条件の検討を行う。哺乳動物の細胞膜には、コレステロールやスフィンゴ脂質に富んだ膜ドメイン(ラフツ)が存在する。近年、これらは細胞間情報伝達の場として重要な機能を持つことが明らかとなりつつある。細胞がシグナルを受け取ったときに多くのシグナル分子がこのラフツ画分に集積してくることが報告されている。そこでシグナル伝達系の網羅的解析を目的としてラフツ画分へ移行するタンパク質のダイナミックな挙動を解析した。ラフツを反映していると考えられているDIG(Detergent Insoluble Glycolipid enriched membrane)のIPGストリップを用いた二次元電気泳動によるプロテオーム解析では約50のスポットが見られた、しかしながらMALDI-TOF/MSにより疎水性の強い膜タンパク質やシグナル分子は同定されなかった。16-BAC/SDS-PAGEによるプロテオーム解析の結果、DIG画分には約30のタンパク質のスポットが確認された。解析の結果、lckや三量体Gプロテインサブユニットなどが同定された。T細胞受容体を刺激し、その前後でDIG画分に移行するシグナル分子をウエスタンブロッティングにより解析した。その結果、SHP-1やZap-70が刺激後にラフツに移行してくることが判明した。T細胞受容体を刺激し、その前後でラフツに移行するシグナル分子を網羅的に解析することでT細胞受容体のシグナル伝達系の全体像を明らかにできる可能性が示された。しかし、これらは発現量の少ないタンパク質が多く、今後の課題として、ラフツの大量調製法の開発、感度の高い分析法の必要性が考えられた。

目的是建立一种分析方法，该方法可以全面地分析细胞信号反应引起的蛋白质的动态行为，而无需集中于单个蛋白质以及蛋白质组学分析。目的是为此目的建立一种分析方法，并通过二维电泳研究细胞分馏条件和分离条件。哺乳动物细胞膜含有富含胆固醇和鞘脂的膜结构域（筏）。近年来，很明显，这些功能具有重要的功能，作为细胞 - 细胞通信的站点。据报道，当细胞收到信号时，许多信号分子在该raftus级分中积聚。因此，我们分析了转移到木筏分数的蛋白质的动态行为，以全面分析信号转导系统。在蛋白质组学分析中，使用挖掘的IPG条（洗涤剂不溶性糖脂富集的膜）发现了大约50个斑点，这被认为反映了筏，但是MALDI-TOF/MS并未识别高度疏水性膜膜蛋白或信号分子。使用16-BAC/SDS-PAGE的蛋白质组分析表明，在挖掘部分中发现了大约30个蛋白质斑点。分析表明LCK和三聚体G蛋白亚基。刺激T细胞受体并在其之前和之后迁移到挖掘部分的信号分子通过蛋白质印迹分析。结果，发现SHP-1和ZAP-70在刺激后转变为筏。已经表明，对刺激T细胞受体并在此之前和之后迁移到木筏的信号分子的全面分析可能揭示了T细胞受体的信号转导系统的整体情况。但是，这些蛋白质中的许多人几乎没有表达，未来的挑战被认为是筏子大规模制备方法的发展，并且需要高度敏感的分析方法。