翻訳後修飾としてのチロシン硫酸化の空間および時間的制御機構の理解と機能解明

酪氨酸硫酸化作为翻译后修饰的时空控制机制的理解和功能阐明

基本信息

批准号：
22H02262
负责人：
榊原陽一
金额：
$ 10.98万
依托单位：
University of Miyazaki
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2026-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22H02262/
关键词：
チロシン硫酸化翻訳後修飾硫酸転移酵素プロテオミクス

项目摘要

翻訳後修飾としてのチロシン硫酸化は、タンパク質の分泌のためのシグナル、タンパク質間相互作用、さらにウイルス宿主間相互作用の制御に関与する。本研究では、チロシン硫酸化を担う酵素Tyrosylprotein Sulfotransferase (TPST)に関し、細胞レベルおよび個体レベルでのTPST発現時期、発現部位や局在性を明らかにし、いつ、どこで、どの基質タンパク質が何のために硫酸化を受けるのかを解明する。硫酸化を受ける標的タンパク質から考えれば、いつ、どこで、何が、何のためにチロシン硫酸化を受けるのか。本研究計画は、これらのチロシン硫酸化に関する学術的な「問い」を解明することを目的とする。CCK-Sをモデルペプチドとして、LC-MSによる解析技術の検討を行い、ネガティブイオンモードとモジティブイオンモードを併用した硫酸化ペプチドの解析条件を確立することができた。確立した条件を元に、MRM-IDAと呼ばれる手法を駆使することで、硫酸化ペプチドの網羅的な解析が可能になった。ACEIIのペプチドを用いた結果、3種類のACEIIペプチドの内、2種類のACEIIぺプチド(ACEII_1とACEII_3)の硫酸化を酵素活性測定にて見出すことが出来た。その内の1種類のペプチド(ACEII_3)には硫酸化されうるYが4カ所あり、Fの置換ペプチドを用いた結果、3カ所のYが硫酸化を受けることが判明した。ACEIIのペプチドを酵素的に硫酸化し、LC-MSを用いて解析した結果、ACEII_1ペプチドの硫酸化ペプチドを検出することが出来、さらに、MS/MSによる構造解析を行うことが出来た。ゼブラフィッシュのTPSTノックダウン実験で用いた見出したWnt familyの酵素的な硫酸化を確認した結果、humanとzebrafishのWnt2とWnt4aの硫酸化を確認することが出来た。

酪氨酸硫酸化作为翻译后修饰与蛋白质分泌，蛋白质 - 蛋白质相互作用和病毒宿主宿主相互作用的信号传导有关。这项研究将阐明酪氨酸硫代硫代硫代酶（TPST）的时机，表达位点和定位，该酶在细胞和个体水平上负责酪氨酸硫酸盐，并阐明底物蛋白在何时，何处，何处以及在哪里经历硫酸盐。考虑到经历硫酸化的靶蛋白，何时，何地，什么以及为什么会经历酪氨酸硫酸盐？该研究计划旨在阐明有关这些酪氨酸硫化的学术“问题”。使用CCK-S作为模型肽，我们使用LC-MS研究了一项分析技术，并能够使用负离子模式和模块化离子模式建立硫酸化肽的分析条件。基于既定条件，通过使用一种称为MRM-IDA的技术，已经成为可能的硫酸化肽的全面分析。通过使用ACEII肽，通过测量酶活性，发现了三种类型的ACEII肽中两种类型的ACEII肽（ACEII_1和ACEII_3）的硫化。这些肽之一（ACEII_3）具有四个可以被硫化的位置，并且由于将取代的肽用于F，发现三个位置经历了硫酸盐。用LC-MS对ACEII肽进行了酶硫酸并分析，并检测到ACEII_1肽的硫酸化肽，并且MS/MS也可以通过MS/MS进行结构分析。我们证实了Wnt家族的酶促硫酸化，这是在斑马鱼的TPST敲低实验中发现的，结果，我们能够确认人类和斑马鱼的Wnt2和Wnt4a的硫酸化。