翻訳後修飾としてのチロシン硫酸化の空間および時間的制御機構の理解と機能解明

酪氨酸硫酸化作为翻译后修饰的时空控制机制的理解和功能阐明

基本信息

批准号：
22H02262
负责人：
榊原陽一
金额：
$ 10.98万
依托单位：
University of Miyazaki
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2026-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22H02262/
关键词：
チロシン硫酸化翻訳後修飾硫酸転移酵素プロテオミクス

项目摘要

翻訳後修飾としてのチロシン硫酸化は、タンパク質の分泌のためのシグナル、タンパク質間相互作用、さらにウイルス宿主間相互作用の制御に関与する。本研究では、チロシン硫酸化を担う酵素Tyrosylprotein Sulfotransferase (TPST)に関し、細胞レベルおよび個体レベルでのTPST発現時期、発現部位や局在性を明らかにし、いつ、どこで、どの基質タンパク質が何のために硫酸化を受けるのかを解明する。硫酸化を受ける標的タンパク質から考えれば、いつ、どこで、何が、何のためにチロシン硫酸化を受けるのか。本研究計画は、これらのチロシン硫酸化に関する学術的な「問い」を解明することを目的とする。CCK-Sをモデルペプチドとして、LC-MSによる解析技術の検討を行い、ネガティブイオンモードとモジティブイオンモードを併用した硫酸化ペプチドの解析条件を確立することができた。確立した条件を元に、MRM-IDAと呼ばれる手法を駆使することで、硫酸化ペプチドの網羅的な解析が可能になった。ACEIIのペプチドを用いた結果、3種類のACEIIペプチドの内、2種類のACEIIぺプチド(ACEII_1とACEII_3)の硫酸化を酵素活性測定にて見出すことが出来た。その内の1種類のペプチド(ACEII_3)には硫酸化されうるYが4カ所あり、Fの置換ペプチドを用いた結果、3カ所のYが硫酸化を受けることが判明した。ACEIIのペプチドを酵素的に硫酸化し、LC-MSを用いて解析した結果、ACEII_1ペプチドの硫酸化ペプチドを検出することが出来、さらに、MS/MSによる構造解析を行うことが出来た。ゼブラフィッシュのTPSTノックダウン実験で用いた見出したWnt familyの酵素的な硫酸化を確認した結果、humanとzebrafishのWnt2とWnt4aの硫酸化を確認することが出来た。

酪氨酸硫酸化作为一种翻译后修饰，参与蛋白质分泌、蛋白质-蛋白质相互作用以及病毒-宿主相互作用的调节信号。在这项研究中，关于负责酪氨酸硫酸化的酶酪氨酰蛋白磺基转移酶（TPST），我们在细胞和个体水平上阐明了TPST表达的时间、位点和定位，并研究了TPST表达的时间、地点、底物蛋白以及这项研究的目的是澄清硫酸是否发生硫酸化。考虑到进行硫酸化的目标蛋白，它在何时、何地、什么以及出于什么目的进行酪氨酸硫酸化？本研究计划旨在澄清有关酪氨酸硫酸化的这些学术问题。使用 CCK-S 作为模型肽，我们研究了 LC-MS 分析技术，并能够使用负离子模式和正离子模式建立硫酸化肽的分析条件。通过充分利用基于既定条件的 MRM-IDA 方法，可以对硫酸化肽进行综合分析。通过使用ACEII肽，我们能够通过酶活性测定来检测3种ACEII肽中的2种ACEII肽（ACEII_1和ACEII_3）的硫酸化。其中一种肽(ACEII_3)具有四个可被硫酸化的Y位置，并且通过使用F的取代肽，发现三个Y位置发生硫酸化。将ACEII肽酶硫酸化并使用LC-MS对其进行分析，结果能够检测出ACEII_1肽的硫酸化肽，此外，我们能够使用MS/MS进行结构分析。通过确认斑马鱼 TPST 敲低实验中发现的 Wnt 家族的酶促硫酸化，我们能够确认人类和斑马鱼中 Wnt2 和 Wnt4a 的硫酸化。