感覚器特異化における転写因子ネットワークの遺伝解析

感觉器官规范中转录因子网络的遗传分析

基本信息

批准号：
12028237
负责人：
岡部正隆
金额：
$ 1.34万
依托单位：
National Institute of Genetics
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

cut遺伝子の機械刺激受容器前駆細胞の発現に十分なcis制御領域は、転写開始点から-30kbに存在する2.8kbのゲノム領域(A3)に存在していることが報告されている。今年度はこのA3領域をより細分化し、cut遺伝子の発現に必要十分な細小ゲノム断片を同定することを目標とした。A3領域を細分化してlacZレポーターと融合させたDNAコンストラクトを構築し、遺伝子組換えショウジョウバエの作成を行い、cut遺伝子の発現に十分なcis調節領域を狭めることを試みた。その結果、cut遺伝子の発現にはA3領域内の127bpのゲノム断片で十分であることが明かとなった。この127bp内には上流因子の一つと考えているbHLH型転写因子の結合配列であるE-boxが2ケ所存在した。一方、127bpゲノム断片内の3'側端の28bpを削ったコンストラクトは、E-boxを削らないにも関わらず、機械刺激受容器前駆細胞における発現に十分ではなかった。そこでこの28bpにbHLH型転写因子とは異なる上流因子が作用する可能性を考えた。28bpを3領域に分割し、それぞれに塩基置換を施したDNAコンストラクトを持った遺伝子組換えショウジョウバエを作成し、この28bp内の必要な塩基配列を明らかにした。その結果、127bpの内、3'端の19bpの塩基配列が必要であることが明かとなった。poxn遺伝子の発現制御領域の解析は過去に報告がないため、poxn遺伝子の転写開始点の周辺を中心にして化学刺激受容器前駆細胞に特異的に発現させるためのcis調節領域の同定を行った。poxn遺伝子の全exonを含む16kbのゲノム領域をクローニングし、それを細分化したレポーターコンストラクトを作成した。遺伝子組換え動物を作成し、cis調節領域の活性をin vivoで検討した。その結果、転写開始点より上流4.2kbのゲノム領域に化学刺激受容器前駆細胞を含むすべてのpoxn発現細胞においてレポーター遺伝子の発現を確認した。転写開始点上流1.7kbおよび1.5kbのレポーターコンストラクトでは十分な活性を得る事ができなかった。

据报道，在基因组区域（A3）的2.8 kb的基因组区域（A3）中存在一个足以表达CIS调节区域，距转录起源为-30 kb。今年，目标是进一步细分了该A3区域，并确定小的基因组片段，这些片段是必要且足以表达切割基因的。我们构建了一个DNA构建体，该构建体分为A3区域并与LACZ报告基因融合，并创建了一个转基因的果蝇，以缩小足以表达切割基因的顺式调节区域。结果，可以发现A3区域内的127 bp基因组片段足以表达切割基因。在这127bp中，有两个电子盒，它们是BHLH转录因子的结合序列，这些序列被认为是上游因子之一。另一方面，尽管没有切断E-box，但在127 bp基因组片段中切断28 bp的构建体在机械刺激的受体祖细胞中不足以表达。因此，我们认为上游因子与BHLH型转录因子不同的可能性可能对这28 bp作用。将28bp分为三个区域，并用每个带有碱基取代的DNA构建体产生了遗传修饰的果蝇，并揭示了该28BP中所需的基础序列。结果，揭示了3'端处的19bp核苷酸序列在127bp中是必需的。由于未报告对POXN基因的表达控制区域的先前分析，因此我们鉴定了一个在化学刺激受体祖细胞中特异性表达的CIS调节区域，以POXN基因的转录起源为中心。克隆了一个16 Kb的基因组区域，该区域包含所有POXN基因的外显子，并创建了一个记者构建体，分为两部分。创建了重组动物，并在体内检查了顺式调节区域的活性。结果，在从转录起始点上游的基因组区域4.2 kb中，在所有表达POXN的细胞（包括化学刺激的受体前体细胞）中证实了报告基因的表达。记者在转录起点上游的1.7 kb和1.5 kb处的构造没有提供足够的活动。