上陸時の器官進化の保守と革新を可視化するGCM２複合体標的遺伝子座の網羅比較解析

GCM2复杂靶位点全面对比分析，可视化着陆过程中器官进化的维持和创新

基本信息

批准号：
19K07258
负责人：
岡部正隆
金额：
$ 2.75万
依托单位：
Jikei University School of Medicine
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2019
资助国家：
日本
起止时间：
2019-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19K07258/
关键词：
マウスゼブラフィッシュ Gcm2 HEK293 転写 TAD APEX 副甲状腺鰓転写制御ゲノム CRISPR/Cas9 Gcm 発生進化

项目摘要

APEX2を結合したマウス及びゼブラフィッシュのGCM2（GCM2-APEX2）をマウスHEK293細胞株に導入し、APEX2によってビオチン化される分子の細胞内局在を比較した。マウスGCM2-APEX2では、ビオチン化された分子は核で少なく、細胞質に多く検出された。一方、ゼブラフィッシュGCM2-APEX2では、ビオチン化された分子のほとんどが核に検出された。マウスGCM2タンパク質自体は培養細胞内に検出されにくく、ゼブラフィッシュGCM2タンパク質は核に強く検出されることから、ゼブラフィッシュGCM2タンパク質は安定して核内にとどまるのに対し、マウスGCM2タンパク質は核から細胞質に移動して分解されている可能性が示唆された。２種のGCM2間の転写活性化能をルシフェラーゼアッセイにより定量化した。48時間の結果では2種で大きな違いは認められなかったが、両者の転写活性化ドメイン(TAD)を入れ替えた様々なキメラGCM2を作成し転写活性化能を比較したところ、マウスのTAD2はゼブラフィッシュのTAD2よりも高い転写活性化能を示した。さらにこれらに比較して、ゼブラフィッシュTAD1-マウスTAD2のキメラGCM2は、非常に高い転写活性化能を示すことも明らかとなり。TAD1とTAD2の組み合わせによって転写活性化能が大きく変化することが明らかとなった。2016年Guan等がヒトGCM2のTAD1内の1アミノ酸置換がhyperparathyroidismを引き起こすことをすでに示しているが、今回の実験でも、TAD1とTAD2の両者が転写活性化能の制御に重要な役割を果たすことが示唆された（第45回日本分子生物学会年会、第128回日本解剖学会総会・全国学術集会にて発表）。

将APEX2结合的小鼠和斑马鱼GCM2（GCM2-APEX2）引入到小鼠HEK293细胞系中，并比较了由APEX2生物素化的分子的亚细胞定位。在小鼠GCM2-APEX2中，发现生物素化的分子在细胞核中较少，而在细胞质中则更多。另一方面，在斑马鱼GCM2-APEX2中的核中检测到大多数生物素化的分子。在培养的细胞中很难检测到小鼠GCM2蛋白本身，斑马鱼GCM2蛋白在细胞核中被强烈检测到，这表明斑马鱼GCM2蛋白在细胞核中保持稳定，可能是小鼠GCM2蛋白从细胞核迁移到细胞质质量，并且是污染的。通过荧光素酶测定法对两个GCM2之间的转录激活势进行了定量。尽管在48小时结果中两种物种之间未观察到显着差异，但是产生了两者的转录激活结构域（TAD）的各种嵌合GCM2，并比较了转录激活能力，并将转录激活能力与小鼠中的TAD2进行了比较。此外，相比之下，已经揭示了斑马鱼TAD1小鼠TAD2的嵌合GCM2具有很高的转录激活能力。已经揭示了TAD1和TAD2的组合显着改变了转录激活能力。 2016年，Guan等人。已经表明，人类GCM2中TAD1中的一种氨基酸取代会导致甲状旁腺功能亢进症，但该实验也表明TAD1和TAD2在调节转录激活能力方面都起着重要作用（在日本分子生物学学会的第45届年度会议上介绍，并在日本生物学和第128届年度年度Anato of Anatosity and National Anterato of National学术会议上）。