高等植物葉緑体のチオレドキシンカスケードに調節される酵素群

高等植物叶绿体中硫氧还蛋白级联调控的酶

基本信息

批准号：
12025207
负责人：
久堀徹
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Tokyo Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12025207/
关键词：
チオレドキシン葉緑体 ATP合成酵素ジスルフィド結合

项目摘要

1.酸化還元カスケードを解明する方法として、活性中心の片側のシステインをセリンに置換した変異チオレドキシンを用いて、葉緑体内の一連の標的酵素を捕獲し、これらをアミノ酸のレベルで同定した。その結果、これまで葉緑体チオレドキシンの標的として知られている酵素以外に、新たに4種類の酵素をチオレドキシンと相互作用する候補として同定した。これらのタンパク質あるいはそのホモログについて、アラビドプシスの全RNAからRT-PCR法によって標的遺伝子をクローニングして発現系を構築し、リコンビナント蛋白質を得た。これらの酵素は、分子内にジスルフィド結合を持ち、実際にチオレドキシンと相互作用するか、あるいはその酵素活性が酸化還元によって変化することがわかった。2.葉緑体ATP合成酵素のγサブユニットの調節部位近傍については、調節機能を担う二つのCysの近傍に変異を導入することで、調節機能に直接関与するアミノ酸配列の同定を試みた。そして、この領域がチオレドキシンとの相互作用および阻害サブユニットであるεサブユニットとの相互作用に重要であること、調節領域そのものの構造変化が調節に重要であることを示唆する結果を得た。さらに、γサブユニットの調節領域を含む150アミノ酸残基を安定に複合体が得られる好熱菌複合体の発現系に導入した。この複合体を用いて、1分子の回転観察実験を行い、酵素の制御が1分子レベルでどのように観察されるかを調べた。その結果、酵素を不活性型に陥れる酸化状態では、分子の回転そのものが妨げられるという結果を得た。

1。作为阐明氧化级联的一种方法，使用突变的硫糖苷捕获叶绿体中的一系列靶向酶，其中一种在活性中心上的半胱氨酸用丝氨酸代替，并在这些丝氨酸上替换，这些丝氨酸被鉴定出氨基酸。结果，除了被称为氯绿色硫氧还蛋白的靶标的酶外，已经将四种新酶确定为与tioredoxin相互作用的候选者。对于这些蛋白质或其同源物，它们从拟南芥所有RNA的靶向基因克隆了靶向基因，以构建一个表达系统，并获得了重组蛋白。发现这些酶在分子分子中具有Zithlfide键，实际上与硫氧还蛋白相互作用或由于氧化降低而导致其酶活性。 2。对于叶绿体ATP合成酶的γ亚基的调节位点附近，我们试图通过在两个Cys附近引入一个突变来鉴定直接参与调节功能的氨基酸序列，这是负责的。调整功能。它还提出，该区域对于与硫毒素的相互作用以及与抑制性亚基的相互作用以及与ε亚基的相互作用很重要，并且调整区域本身的结构变化对于调整很重要。此外，在稳定地获得复合材料的表达中，引入了150个氨基酸残基，包括γ亚基的调节区域。使用这种复合物，我们进行了单个分子的旋转观测实验，并检查了如何在一个分子水平上观察到对酶的控制。结果，在酶不活跃的氧化态下，分子本身的旋转受到阻碍。