高等植物葉緑体のチオレドキシンカスケードの解明

高等植物叶绿体中硫氧还蛋白级联的阐明

基本信息

批准号：
11151209
负责人：
久堀徹
金额：
$ 0.9万
依托单位：
Tokyo Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、まず、標的酵素(ATP合成酵素)とチオレドキシン(Trx)との相互作用の解析を行った。ATP合成酵素では、複合体の中心部分のサブユニットγがTrxの標的を持っているため、このサブユニットを中心に変異導入を行った。調節に直接関与するCys(ホウレンソウ由来のATP合成酵素γサブユニットの^<199>Cysと^<205>Cys)近傍に、アミノ酸側鎖の電荷の変更、アミノ酸数残基の削除などの変異を導入したが、Trxとの相互作用に直接影響を与えるような変異は見つからなかつた。葉緑体由来のATP合成酵素とTrx(f型とm型)との相互作用については、葉緑体から直接単離精製したATP合成酵素とリコンビナントのTrxf型とm型を用いて検討した。両者の相互作用を調べているが、今のところ両者の親和性の違いを示す積極的なデータは得られていない。次に、植物葉緑体内のTrxと相互作用する標的タンパク質の全容を解明するために、実験系の整備を行った。植物葉緑体内にTrxがどの程度含まれているかを抗Trxポリクローナル抗体染色法を用いて評価した。さらに正確な定量を目指して、現在合成ペプチドを抗原としてモノクローナル抗体を作成している。また、アフィニティークロマトグラフィーにより、標的となるタンパク質の探索を進めている。活性調節の分子機構の研究では、葉緑体ATP合成酵素のγサブユニットの回転を蛍光顕微鏡下で直接観察することに成功した。γサブユニットの調節部位近傍については、調節機能を担う二つのCysの近傍に変異を導入することで、調節機能に直接関与するアミノ酸配列の同定を試みた(投稿準備中)。さらに、γサブユニットの調節領域を含む150アミノ酸残基を安定に複合体が得られる好熱菌複合体の発現系に導入した。得られた好熱菌複合体は、酸化還元や阻害サブユニットであるεサブユニットによって調節され葉緑体酵素よりも安定で遺伝子操作も容易であり、非常に有用なモデル実験系である(J.Biol.Chem.in press)。

在本研究中，我们首先分析了目标酶（ATP 合酶）和硫氧还蛋白（Trx）之间的相互作用。在ATP合酶中，复合物中心部分的γ亚基有Trx靶标，因此突变主要在该亚基中引入。我们做了一些突变，例如改变氨基酸侧链的电荷，删除Cys附近的几个氨基酸残基（源自菠菜的ATP合酶γ亚基的^<199>Cys和^<205>Cys），这些突变直接参与然而，没有发现直接影响与 Trx 相互作用的突变。使用直接从叶绿体中分离和纯化的 ATP 合酶以及重组 Trxf 和 m 型研究了叶绿体来源的 ATP 合酶和 Trx（f 和 m 型）之间的相互作用。我们正在研究两者之间的相互作用，但到目前为止还没有获得显示它们亲和力差异的积极数据。接下来，我们建立了一个实验系统来阐明与植物叶绿体中 Trx 相互作用的目标蛋白的全貌。使用抗 Trx 多克隆抗体染色评估植物叶绿体中所含 Trx 的程度。为了实现更准确的定量，我们目前正在使用合成肽作为抗原来制备单克隆抗体。我们还使用亲和色谱法寻找目标蛋白。在活性调控分子机制研究中，我们成功地在荧光显微镜下直接观察到叶绿体ATP合酶γ亚基的旋转。对于γ亚基的调控位点附近，我们试图通过在负责调控功能的两个Cys附近引入突变来鉴定直接参与调控功能的氨基酸序列（准备提交）。此外，将含有γ亚基调节区的150个氨基酸残基引入嗜热复合物表达系统中，从而获得稳定的复合物。所得的嗜热复合物受氧化还原和ε亚基（抑制性亚基）的调节，比叶绿体酶更稳定且更易于遗传操作，使其成为非常有用的模型实验系统（J.Biol.Chem.in press）。