葉緑体共役因子CF1のヌクレオチド結合部位の不均一性の決定要因

叶绿体耦合因子 CF1 核苷酸结合位点异质性的决定因素

基本信息

批准号：
06740603
负责人：
久堀徹
金额：
$ 0.58万
依托单位：
Yokohama City University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06740603/
关键词：
葉緑体共役因子 F_1-ATPase 抗体 TNP-ADP

项目摘要

本研究では、葉緑体共役因子CF_1のヌクレオチド結合部位の不均一性を決定する要因を明かにすることを目的として次のような研究を行ない、以下の結果を得た。(1)CF_1のマイナ-サブユニットに対する抗体の作成温和なCF_1の抽出方法として、まず葉緑体チラコイド膜をピロリン酸で洗浄して膜表面のRuBPカルボキシラーゼを除去し、次に溶液のイオン強度を急激に変化させることでCF_1を得る方法^<1)>を用い、CF_1を構成する5つのサブユニットが全て揃ったCF_1を得た。この標品を電気泳動でそれぞれのサブユニットに分離した後に、それぞれの蛋白バンドを電気泳動によってゲルから溶出し、単一のサブユニット標品を得た。得られた各サブユニットそれぞれ10〜20μgをラットに対して免疫し、それぞれの抗体を作成した。γ、δサブユニットに対する抗体は、何れもβサブユニットと交差したので、単離βサブユニットを用いて、βと交差する成分を吸収した。抗ε抗体については、現在作成中である。(2)CF_1サブユニット間の架橋の試み昨年夏、イギリスのJ.WalkerらがミトコンドリアF_1の主要部分の分子構造をX線結晶解析によって明かにした^<2)>。その結果、我々が当初予想したとおり、基質の結合状態とγサブユニットのβサブユニットに対する相対的な位置に関連があり、酵素分子が不均一な状態にあることが明らかにされた。CF_1基質アナログであるTNP-ADPを用いて光親和性標識した場合、α・β両サブユニットが標識されることは既に報告した^<3)>が、一般に非触媒部位に結合すると報告されているピロリン酸を拮抗阻害剤として用いることにより、両サブユニットへの結合を分離することに成功した。現在、この標品についてサブユニット間の架橋を試みている。1)Strotmann,H.,et al.Biochim.Biophys.Acta(1973)314, 202-2102)Abrahams,J.P.et al.Nature(1994)370,621-6283)Hisabori,T.,et al.J.Biochem.(1993)114,324-328

在这项研究中，进行了以下研究，目的是揭示确定叶绿体因子CF_1均匀性以确定混合连接位点的均匀性并获得以下结果的因素。（1）作为CF_1的轻度CF_1提取方法CF_1对亚基的抗体产生的少量创建，首先用属于副蝶骨酸的氯绿色类墨乳膜，去除膜表面上的roubp羧基酶，然后将其溶液的离子强度使用迅速更改CF_1的方法，我们获得了CF_1的所有五个亚基。通过电子游泳将该项目分离到每个子单位中后，通过电动游泳从凝胶中洗脱了每个蛋白质，并获得了一个单个亚基靶。每个获得的亚单位10至20μg都对大鼠免疫，并产生每种抗体。由于γ和δ亚成与β亚单位相交的抗体，因此使用分离的β亚基吸收了交叉β的成分。目前正在创建抗抗体。（2）去年夏天对CF_1亚基之间的桥梁的检查，J.Walker和英国其他人通过X -Ray Crystal Analysis^<2揭示了线粒体F_1的主要部分的分子结构。结果，正如我们最初预期的那样，它与底物的结合状态以及γ-subunit与β亚基的相对位置有关，并且酶分子是不均匀的。据报道，CF_1基板类似物TNP-ADP已经报道了α和β的子单元均被签名^<3）>，它通常通过将其与非催化剂位点结合。对抗者，我们成功地将键与两个亚单位分开。目前，我们正在尝试在此项目的子单位之间桥接。 1）Strotmann，H。等人Biochim.biophys.acta（1973）314，202-2102）Abrahams，J.P.Et Al.Nature（1994）370,621-6283）