蛍光標識グルコースを用いた単一細胞のグルコース取り込み・機能連関の解析

使用荧光标记的葡萄糖分析单细胞中的葡萄糖摄取和功能关系

基本信息

批准号：
11877005
负责人：
稲垣暢也
金额：
$ 0.32万
依托单位：
Akita University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至 2000
项目状态：
已结题

项目摘要

従来、細胞膜を介したグルコース輸送ならびに組織のグルコース利用に関する研究は、主に放射性標識したグルコース誘導体を用いて行われてきた。これらの方法は優れた定量性をつが、単一細胞レベルでの分析が困難であった。申請者らは単一細胞におけるグルコース取り込みのリアルタイム計測を行う目的で、2-デオキシグルコースに蛍光標識した2-(N-(nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-2-deoxyglucose(2-NBDG)を用いた。その結果、まず哺乳動物細胞のグルコーストランスポーター(GLUT)を介して、グルコースと類似したキネティクスをもって細胞内に取り込まれること初めて明らかにした。次に2-NBDGとCa^<2+>指示薬であるfura-2を用いることにより、ラット単一膵島細胞におけるグルコースの取り込みおよび細胞内Ca^<2+>濃度の変動のリアルタイム計測を試みた。その結果、高グルコース刺激によりインスリン分泌を示すようなグルコースセンサー機能を有するGLUT2発現膵β細胞は、グルコース刺激に対して細胞内カルシウム濃度上昇を示すと同時に、α細胞に比べてはるかに多くの2-NBDGを取り込むことが明らかになった。これらの結果は、単一細胞レベルでグルコース取り込みと細胞機能の同時評価を行った国内外で初めての試みであり、J.Biol.Chem(275:22278,2000)に掲載された。本研究ではさらに、代謝阻害剤を用いて、グルコース刺激によるインスリン分泌にはグルコースの取り込みとそれに続く代謝が重要であるというグルコース代謝説を直接支持する結果も得た。現在、2-NBDGを用いて、現在未だに十分に解明されていない神経活動とグルコースの取り込みとの相関を、単一細胞レベルあるいはスライスで観察を試みている。

以前，主要使用放射性葡萄糖衍生物进行了通过细胞膜传输的葡萄糖转运以及在组织中使用葡萄糖的研究。这些方法在定量方面非常好，但是很难在单个细胞水平上进行分析。申请人具有2-（Nitrobenz-2-Oxa-1，3-二唑-4-基），并在2-脱氧过程中标记为荧光，目的是在单个细胞中实时测量葡萄糖使用（2-nbdg）。结果，首先揭示了它首先通过哺乳动物细胞的灰色笼子转运蛋白（GLUT）结合到具有类似葡萄糖的细胞中。接下来，通过使用2-NBDG和CA^<2+>启发的药物Fura-2，我们试图捕获大鼠单个胰岛细胞中的葡萄糖，并测量细胞内Ca^<2+>的实时波动。结果，具有葡萄糖传感器函数的GLUT2-表达胰腺β细胞表明通过高葡萄糖刺激表明胰岛素分泌，表明细胞内钙浓度以增加葡萄糖刺激，同时增加了α -Cells cells刺激。已经揭示了-NBDG是进口的。这些结果是日本和国外的首次尝试，这些尝试在单个细胞水平上以葡萄糖为单位并同时评估了细胞功能，并发表在J.Biol.Chem（275：22278,2000）中。在这项研究中，我们还获得了葡萄糖代谢理论的直接支持，即使用代谢抑制剂通过葡萄糖刺激将葡萄糖和随后的代谢掺入胰岛素分泌。目前，2-NBDG试图观察当前脱离神经活性与葡萄糖的掺入之间的相关性，葡萄糖仍被很好地阐明。