神経特異的に発現する新規SRタンパク質、NSSR1および2の機能と生理的役割

神经元中特异表达的新型 SR 蛋白 NSSR1 和 2 的功能和生理作用

基本信息

批准号：
12029225
负责人：
塚原俊文
金额：
$ 1.41万
依托单位：
National Center of Neurology and Psychiatry
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至 2000
项目状态：
已结题

项目摘要

神経特異的に発現する新規スプライシング因子であるNSSR1および2は単一の遺伝子から選択的スプライシングの結果二種の産物が生成する。今年度はNSSR遺伝子の機能を明らかにするため、遺伝子破壊マウスの作成を試みた。まず、第一エクソンを含む約16kbのNSSRゲノム遺伝子を単離し、制限酵素マップを作成した。マップに基づき、第一エクソンとその周辺をNeoカセットと組み換えるターゲティングベクターを構築した。ターゲティングベクターをエレクト由ポレーション法によってES細胞に導入し、遺伝子が組み換えられた細胞を選択した。組み換えES細胞をブラストサイトにマイクロインジェクションすることによってマウスを創生した。これまで、二回試みそれぞれ90%および80%のキメラを得たが残念ながら一カ月程度で死亡してしまったため、遺伝子破壊マウスの作成には至っていない。現在、3回目のインジェクションを行っている。一方、神経でのスプライシング機構におけるNSSR遺伝子の役割を明らかにするため、NSSR1あるいは2に結合するタンパク質の検索を行う必要がある。結合タンパク質の検索は通常、酵母ツーハイブリッドシステムを利用するが、我々は基質となるRNA存在下でのみNSSRに結合するタンパク質を検索するため、スリーハイブリッドシステムによる遺伝子スクリーニングを試みた。これは、基質となるミニジーンを酵母に導入し、基質存在下でツーハイブリッドを行うものである。システムの準備を完了し、現在はスクリーニングを開始したばかりであるが、幾つかのポジティブクローンを得ており、今後の解析が待たれる。

NSSR1和2，新型神经表达的剪接因子是通过替代剪接产生的，从单个基因产生，从而产生两种产物。今年，我们试图创建基因中断的小鼠来阐明NSSR基因的功能。首先，分离了大约16 kb的NSSR基因组基因，并创建了限制酶图。根据地图，构建了一个靶向载体，以将第一个外显子及其周围环境与新盒子重组。通过电穿孔方法将靶向载体引入ES细胞中，并选择了具有基因重组的细胞。小鼠是通过将重组ES细胞微型注射到爆炸位点而产生的。到目前为止，已经分别以90％和80％的嵌合体获得了两次尝试，但不幸的是，它已经在一个月内死亡，因此尚未创建基因干扰的小鼠。他目前正在进行第三次注射。另一方面，为了澄清NSSR基因在神经中的剪接机制中的作用，有必要搜索与NSSR1或2结合的蛋白质。尽管在寻找结合蛋白质的蛋白质通常利用酵母菌的两性杂交系统，但我们尝试与蛋白质相结合，以搜索仅在蛋白质中搜索蛋白质的蛋白质。这涉及将底物微基因引入酵母，并在底物存在下进行两杂交。该系统已经准备好并刚刚开始筛选，但是已经获得了几个积极的克隆，并且正在期待未来的分析。