神経特異的に発現する新規SRタンパク質、NSSR1および2の機能と生理的役割

神经元中特异表达的新型 SR 蛋白 NSSR1 和 2 的功能和生理作用

基本信息

批准号：
12029225
负责人：
塚原俊文
金额：
$ 1.41万
依托单位：
National Center of Neurology and Psychiatry
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至 2000
项目状态：
已结题

项目摘要

神経特異的に発現する新規スプライシング因子であるNSSR1および2は単一の遺伝子から選択的スプライシングの結果二種の産物が生成する。今年度はNSSR遺伝子の機能を明らかにするため、遺伝子破壊マウスの作成を試みた。まず、第一エクソンを含む約16kbのNSSRゲノム遺伝子を単離し、制限酵素マップを作成した。マップに基づき、第一エクソンとその周辺をNeoカセットと組み換えるターゲティングベクターを構築した。ターゲティングベクターをエレクト由ポレーション法によってES細胞に導入し、遺伝子が組み換えられた細胞を選択した。組み換えES細胞をブラストサイトにマイクロインジェクションすることによってマウスを創生した。これまで、二回試みそれぞれ90%および80%のキメラを得たが残念ながら一カ月程度で死亡してしまったため、遺伝子破壊マウスの作成には至っていない。現在、3回目のインジェクションを行っている。一方、神経でのスプライシング機構におけるNSSR遺伝子の役割を明らかにするため、NSSR1あるいは2に結合するタンパク質の検索を行う必要がある。結合タンパク質の検索は通常、酵母ツーハイブリッドシステムを利用するが、我々は基質となるRNA存在下でのみNSSRに結合するタンパク質を検索するため、スリーハイブリッドシステムによる遺伝子スクリーニングを試みた。これは、基質となるミニジーンを酵母に導入し、基質存在下でツーハイブリッドを行うものである。システムの準備を完了し、現在はスクリーニングを開始したばかりであるが、幾つかのポジティブクローンを得ており、今後の解析が待たれる。

NSSR1 和 NSSR2 是在神经元中特异性表达的新型剪接因子，由于单个基因的选择性剪接而产生两种类型的产物。今年，为了阐明NSSR基因的功能，我们尝试培育基因破坏的小鼠。首先，我们分离出包含第一个外显子的约 16kb NSSR 基因组基因并创建了限制性酶图谱。根据该图谱，构建了靶向载体，将第一个外显子及其周围区域与 Neo 盒重组。通过电穿孔将靶向载体导入ES细胞，筛选发生基因重组的细胞。通过将重组 ES 细胞显微注射到胚细胞中产生小鼠。到目前为止，我们已经两次尝试分别获得90%和80%的嵌合体，但不幸的是它们在大约一个月内就死亡了，所以我们还没有能够创造出基因被破坏的小鼠。他目前正在接受第三次注射。另一方面，为了阐明NSSR基因在神经剪接机制中的作用，有必要寻找与NSSR1或2结合的蛋白质。尽管酵母二杂交系统通常用于寻找结合蛋白，但我们尝试使用三杂交系统进行遗传筛选，以寻找仅在底物RNA存在的情况下与NSSR结合的蛋白质。在该方法中，将充当底物的小基因引入酵母中，并在底物存在下进行双杂交。我们已经完成了系统的准备，刚刚开始筛选，但我们已经获得了几个阳性克隆，期待未来的分析。