遺伝子変異のインビボ修復による疾患治療法の開発

通过体内修复基因突变开发疾病治疗方法

基本信息

批准号：
19659084
负责人：
塚原俊文
金额：
$ 2.05万
依托单位：
Japan Advanced Institute of Science and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2008
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究は、Leigh症候群患者に存在するミトコンドリアATPase6遺伝子のT→C点変異症例を対象に、患者由来細胞を用いたin vivo実験を行って遺伝子修復するための方法を確立することを目的としている。これまでに、患者細胞由来の全DNA、全RNAあるいはin vitroで調製した変異を持つ全長のATPase6-mRNAをターゲットに塩基配列特異的な光化学的脱アミノ化を試み、ヘアピン型CVU含有ODNを用いた部位特異的なCの脱アミノ化が可能であることを示した。RNAの修復効率は、in vitroで合成した全長のATPase 6-mRNAをターゲットした場合は10.8%、Leigh脳症患者由来の全RNAの場合は7.6%であった。本年度はin vivoで同様のRNA修復を確認するため、ヘアピン型CVU含有ODNを患者細胞内に導入し、RNA修復の有無を調べることを目的に実験を行った。まず、無菌状態でのUV照射法を検討するため、様々な条件で細胞培養皿を介した脱アミノ化を試みたところ、スライドグラスを介してUV照射を行った場合に、最も塩基置換の効率が高いことが示された。この結果から、以後の実験にはガラスボトムディッシュ:ホール径27mmを用いた。引き続き、Leigh脳症患者由来の初代培養線維芽細胞にヘアピンにヘアピン型CVU含有ODNを導入後、UV照射を行ってRNAの修復を試み、RFLPによって脱アミノ化を確認した。しかし、RNAの修復は全く認められなかった。GFPプラスミドを指標として確認したところ、本培養細胞は遺伝子導入効率が高いとされるLipofectamine LTXやFuGENE 6によっても遺伝子が導入されなかったことから、今回の変異修復の失敗はODNの導入効率が極めて低いことが原因であると考えられた。今後、物理的導入法も含め、効率の高い遺伝子導入法の検索が必要であると結論した。

这项研究旨在通过使用患者衍生的细胞进行体内实验来建立一种遗传修复方法，以在Leigh综合征患者中存在T→C点突变的T→C点突变。到目前为止，我们已经尝试针对所有DNA，总RNA或全长ATPASE6-MRNA，并以体外制备的突变作为目标，并证明了使用含有发夹型CVU的ODN的C特异性脱氨酸是C的。当靶向在体外合成的全长ATPase 6-MRNA时，RNA修复效率为10.8％，来自Leigh脑病患者的总RNA合成7.6％。在今年，为了确认体内类似的RNA修复，将含含Heanpin型CVU的ODN引入患者细胞中，并进行了实验，目的是检查是否存在RNA修复。首先，为了研究无菌状态的紫外线辐照方法，在各种条件下尝试通过细胞培养皿进行脱氨基，并证明，当通过滑动玻璃进行紫外线照射时，碱替代的效率最高。基于这些结果，在以下实验中使用了玻璃底盘：孔直径27毫米。随后，将含有发夹型CVU的ODN引入了从Leigh脑病患者的原发性培养的成纤维细胞引入发夹型中，然后进行紫外线照射以修复RNA，并通过RFLP确认了脱氨酸。但是，未观察到RNA修复。当我们确认GFP质粒为指标时，据说基因LTX和Fugene 6在主要培养细胞中的转移，据说这些基因具有很高的基因转移效率，因此人们认为未能修复突变是由于ODN转移的极低效率而引起的。它得出的结论是，将来有必要搜索高效的基因转移方法，包括物理介绍方法。

项目成果

期刊论文数量（13）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

Protected DNA Probes' capable of strong hybridization without removal of base protecting groups

受保护的 DNA 探针能够进行强杂交，无需去除碱基保护基团

DOI：
发表时间：
2008
期刊：
Nucleic Acids Res. 36
影响因子：
0
作者：
Ohkubo A;Kasuya R;Sakamoto K;Miyata K;Taguchi H;Nagasawa H;Tsukahara T;Watanobe T;Maki Y;Seio K;Sekine M
通讯作者：
Sekine M

'Protected DNA Probes' capable of strong hybridization without removal of base protecting groups.

“受保护的 DNA 探针”能够进行强杂交，无需去除碱基保护基团。

DOI：
发表时间：
2008
期刊：
Nucleic Acids Res. 36
影响因子：
0
作者：
Ohkubo A;Kasuya R;SakamotoK;Miyata K;Taguchi H;Nagasawa H;Tsukahara T;WatanobeT;Maki Y;Seio K;Sekine M
通讯作者：
Sekine M

Change of Expression of ACTNl and Sr3A Genes During Early Stage of Neural Differentiation in P19 Cells

P19细胞神经分化早期ACTN1和Sr3A基因表达变化