Research of Genetic Code Restoration Therapy-Restoration of Mutated RNAs by Artificial RNA Editing

遗传密码修复疗法研究——人工RNA编辑修复突变RNA

基本信息

批准号：
21H02067
负责人：
塚原俊文
金额：
$ 11.15万
依托单位：
Japan Advanced Institute of Science and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、遺伝子の点変異を原因とする疾患に対する治療法として、発現している変異したRNAの変異を人工酵素複合体の導入によってCの脱アミノ化あるいはUへのアミノ基転移による塩基置換によって変異を修復し、疾患を治療する方法の確立を目的としている。劣性遺伝形式の疾患で対立遺伝子の片方が正常であれば疾患は発症しないことから、RNAの修復効率50%以上の実現を目指して研究を行っている。令和3年度はまず、植物由来のRNA編集システムの利用を検討した。植物ではPPRタンパク質のC末端に存在するDYWドメインがCの脱アミノ化を触媒することが判明している。我々はU⇒C RNA編集が顕著に観察されるツノゴケのPPRタンパク質遺伝子からDYWドメインとDYWに相同性を有する2つのドメイン（GRPおよびDRH）遺伝子断片を単離し、PPR56とその標的遺伝子nad4を利用した大腸菌アッセイ系でRNA編集活性を調べた。残念ながらU⇒C置換活性は確認出来ていないが、ツノゴケ由来のDYWはシロイヌナズナ由来に比べC⇒U変換活性が高いことが明らかとなった。そこで、これまでにADAR1やAPOBEC1を用いて人工RNA編集酵素複合体の創成に成功したMS2システムを介してguide RNAと結合させた。この植物由来の人工RNA編集酵素複合体遺伝子をHEK293細胞に導入したところ、非常に効率良いC⇒U変換が認められ、ほとんどの変異RNAが修復されることが判明した。さらに従来のguide RNAを改良し、標的RNAに相補的な配列の両側に1つのMS2 loop RNAを付加することによってAPOBEC1を利用した人工RNA編集酵素でもC⇒U RNA編集効率を50%以上に向上させることに成功した。これらの結果によって、人為的なRNA編集による点変異RNAの修復疾患治療法は実用化レベルに達したと考えている。

在这项研究中，作为基因点突变引起的疾病的治疗方法，我们通过引入人工酶复合物，通过脱氨基C或转氨基为U来进行碱基取代，从而在表达的突变RNA中引入突变。目的是建立修复方法突变并治疗疾病。由于这是一种隐性遗传性疾病，如果其中一个等位基因正常，则该疾病不会发展，因此我们正在进行研究，目标是实现 RNA 修复效率超过 50%。 2021 财年，我们首先考虑使用植物源性 RNA 编辑系统。在植物中，PPR 蛋白 C 末端的 DYW 结构域被发现可催化 C 脱氨基。我们从金鱼藻PPR蛋白基因中分离出一个DYW结构域和两个与DYW同源的结构域（GRP和DRH），其中U⇒C RNA编辑显着，并利用PPR56及其靶基因nad4检测RNA编辑活性。大肠杆菌检测系统。遗憾的是，无法确认U⇒C取代活性，但发现来自金鱼草的DYW比来自拟南芥的DYW具有更高的C⇒U转换活性。因此，我们通过 MS2 系统将其与向导 RNA 结合，该系统之前已成功使用 ADAR1 和 APOBEC1 创建了人工 RNA 编辑酶复合物。当这种源自植物的人工RNA编辑酶复合体基因被导入HEK293细胞时，观察到高效的C⇒U转换，并且发现大多数突变的RNA被修复。此外，通过改进传统的指导RNA并在与目标RNA互补的序列两侧添加一个MS2环RNA，即使使用使用APOBEC1 I的人工RNA编辑酶，C⇒U RNA编辑效率也提高到50%以上。成功地做到了这一点。基于这些结果，我们相信利用人工RNA编辑修复点突变RNA的疾病治疗方法已经达到了实用水平。