HIV-1Vpr蛋白と相互作用する細胞内因子の同定

与 HIV-1Vpr 蛋白相互作用的细胞内因子的鉴定

基本信息

批准号：
11161234
负责人：
間陽子
金额：
$ 1.34万
依托单位：
The Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

HIV-1 Vpr蛋白のG2期arrest、アポトーシス、さらには核移行等の機能の発現機構を解明するために、Vpr蛋白と特異的に相互作用する細胞内蛋白を単離を試みている。1)強いアポトーシス活性を持つVpr蛋白のC末端欠失変異体の解析G2期arrest能を完全に消失しているが、G1期arrest能と強いアポトーシス活性を獲得したVpr蛋白のC末端欠失変異体を見いだし、G2期arrestとアポトーシスは異なる経路で発揮される可能性を示した。同様に、野生型VprもG2期arrestとは異なる機序によるアポトーシス誘導能を有する事を明らかにした。可溶化Vpr蛋白を非感染細胞に添加するとアポトーシスが誘導される事は既に報告されていたが、endogenousなVpr蛋白が細胞をアポトーシス出来るという最初の報告である。2)yeast two-hybrid法によるHIV-1 Vpr結合因子の検索Vpr蛋白によるアポトーシスおよびG2期arrestの発現機序を解明するために、これらの機能に関与するVpr結合細胞内因子を同定を試みた。野生型Vprと同様の発現能、核膜・核への局在能を保持しているが細胞増殖抑制能を完全に消失している、Vpr17-81変異体をbaitとして、yeast two-hybrid法を行った。UNG、HHR23Aを含む5種類の既知の蛋白質と、6種類の未知の蛋白質をコードする遺伝子が同定された。この中で、HHR23Aについては、C末端側UBAドメインがVprとの結合に重要である事、さらに、この結合にはVpr蛋白のα-helix2ドメインの67位Leuおよび74位Ileの各アミノ酸の保存が重要であることを証明した。3)Vpr蛋白とImportinα,βとの相互作用の解析Vpr蛋白の重要な機能である核局在化には、核局在化シグナルとして機能しうる2つのα-helixドメインが共に重要であることを明らかにした。In vitro translationで作製した野性型および変異型Vpr蛋白を用いて、pulldown assayにおいてGST融合型Impα及びβと結合能を解析した。その結果、Vpr蛋白はH2ドメインを介してImpα及びβと相互作用している可能性が示唆された。

为了阐明HIV-1 VPR蛋白的表达机制，例如G2期停滞，凋亡甚至核易位，我们试图分离与VPR蛋白特别相互作用的细胞内蛋白。 1）分析具有强大凋亡活性的VPR蛋白的C末端缺失突变体，尽管G2期停滞能力已完全消失，但我们发现VPR蛋白的C末端缺失突变体已获得G1期相 - 相阻滞能力和强凋亡活性，表明G2相位抑制和凋亡可能会通过不同的途径通过不同的途径。同样，据揭示，野生型VPR也具有与G2停滞的不同机制，以诱导凋亡。已经报道说，在未感染的细胞中添加溶解的VPR蛋白会诱导凋亡，但这是内源性VPR蛋白可以细胞凋亡细胞的第一个报道。 2）通过酵母两杂交搜索HIV-1 VPR结合因子，以阐明VPR蛋白和G2相阻滞的表达机制，我们试图鉴定这些功能中涉及的VPR结合细胞内因子。使用VPR17-81突变体进行酵母两杂化方法，该突变体保持与野生型VPR相同的表达能力以及对核膜和核的定位能力，但完全消除了其细胞增殖抑制能力防止细胞生长。已经鉴定出五种已知的蛋白质，包括UNG和HHR23A，以及编码六种未知蛋白的基因。其中，证明C末端UBA结构域对于与VPR的结合很重要，并且VPR蛋白的α-螺旋蛋白α-螺旋蛋白中的LEU和ILE在位置67和ILE的保存对于结合很重要。 3）分析VPR蛋白与Importinα之间的相互作用，我们揭示了可以用作核定位信号的两个α-螺旋结构域对于核定位都很重要，这是VPR蛋白的重要功能。使用体外翻译产生的野生型和突变体VPR蛋白，在Pulldown分析中分析了GST融合形式IMPα和β的结合能力。结果表明，VPR蛋白可以通过H2结构域与IMPα和β相互作用。