シャペロンCdc37の機能解析

伴侣Cdc37的功能分析

基本信息

批准号：
11153230
负责人：
木村洋子
金额：
$ 1.15万
依托单位：
Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11153230/
关键词：
Cdc37 タンパク質キナーゼポリグルタミン出芽酵母凝集体 hsp104

项目摘要

分子シャペロンCdc37のタンパク質キナーゼに作用する部位を調べるために、出芽酵母を用いたアッセイ系を確立した。すなわち、野生株の出芽酵母にp60^<v-src>の遺伝子を発現させると、p60^<v-src>の高いチロシンキナーゼ活性により酵母は死ぬ。ところがhsp90の変異株ではチロシンキナーゼ活性が保たれず、酵母は生育する。これに、Cdc37遺伝子を大量発生させると、チロシンキナーゼが回復し、酵母は生育できなくなることがわかった。そこで、ランダムな変異をCdc37導入し、酵母が再び生育できる変異体のスクリーニングを試みている。さらに、ポリグルタミンによる凝集体形成や細胞障害機構を解明するために、出芽酵母にポリグルタミンを発現させる系を構築した。出芽酵母中でもポリグルタミンは長さにと発現量に依存して凝集体を形成し、また、ポリグルタミンの長さに依存して生育に若干の遅れを生じた。次に、分子シャペロンの変異株で、凝集体形成の変化を調べた。すると、hsp104の欠損変異株では、凝集体形成がみられなくなり、さらにポリグルタミンは可溶性になり、凝集体の形成にHsp104が関わっていることがわかった。さらに、酸化ストレスによって、凝集体形成の促進が見られた。現在、ポリグルタミンを発現しているhsp104の変異株から可溶性抽出物をとり、培養細胞の抽出物を加え、in vitroで再び凝集体形成がみられないかを検討している。

为了研究作用于蛋白激酶的分子伴侣CDC37的位点，建立了使用萌芽酵母菌的测定系统。换句话说，当p60^<v-src>的基因在野生菌株出芽酵母中表达时，由于p60^<v-src>的高酪氨酸激酶活性而导致的酵母死亡。然而，酪氨酸激酶活性不能保持在HSP90突变株中，酵母菌的生长。已经发现，如果大量产生Cdc37基因，酪氨酸激酶被恢复，酵母无法再生长。因此，我们试图筛选可以通过引入随机突变来重新生长酵母的突变体。此外，为了阐明由多谷氨酰胺引起的聚集体形成和细胞毒性的机制，建立了一种用于表达聚谷氨酰胺的系统。即使在萌芽的酵母中，聚谷氨酰胺也会根据长度和表达水平形成聚集体，并根据聚谷氨酰胺的长度导致生长略有延迟。接下来，在分子伴侣突变体中检查了骨料形成的变化。这表明HSP104有缺陷的突变菌株不再显示骨料形成，并且聚谷氨酰胺变得可溶，导致HSP104参与聚集体的形成。此外，氧化应激促进了骨料形成。当前，可溶性提取物取自表达聚谷氨酰胺的HSP104的突变株，并添加了培养细胞的提取物，我们正在研究是否在体外再次观察到聚集体形成。