Comprehensive profiling of substrate recognition motifs for human kinome

人类激酶组底物识别基序的综合分析

基本信息

批准号：
21H02466
负责人：
杉山直幸
金额：
$ 10.98万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

前年度に引き続き、変性条件下におけるin vitroキナーゼ基質の高深度同定を実施した。得られたキナーゼ-基質間情報に基づき、キナーゼのクラスタリングを行った。キナーゼドメインの相同性に基づく従来の分子系統樹上では離れているが、in vitro基質の類似性が高いキナーゼ群に着目し、リン酸化部位から離れた位置にみられる共通のアミノ酸配列を抽出した。今後、実際にモチーフを含むペプチドを合成し、相互作用解析を実施する予定である。また、in vitroキナーゼ反応を応用した、Motif-centricリン酸化プロテオーム解析によるキナーゼ阻害薬評価法について、Cancers誌に発表した。未変性条件下におけるキナーゼ基質同定法の再検討を行った。変性条件下と比較して、リン酸化効率が悪くキナーゼ基質の同定数は明らかに少ないことから測定法の高感度化を図った。チロシンキナーゼの基質を高選択的に同定するために、酸化金属クロマトグラフィーと配位子交換クロマトグラフィーを併用したチロシンリン酸化ペプチド濃縮法の開発、最適化を行った。また、高深度に取得したキナーゼの基質情報、および公共のキナーゼ基質情報（PhosphoSitePlus）を用いて、基質モデルの改善を行った。ヒトの全タンパク質のすべてのセリン、スレオニン、チロシンに対して、リン酸化されうる部位とその責任キナーゼを予測した。実際に標的既知のキナーゼ阻害薬を処理した細胞のリン酸化プロテオーム解析結果から、予測性能の評価を行った。

延续去年，我们对变性条件下的体外激酶底物进行了深入的鉴定。根据获得的激酶底物信息进行激酶聚类。我们重点研究了一组基于激酶结构域同源性的常规分子树上相距较远，但在体外底物方面具有较高相似性的激酶，并提取了在远离磷酸化位点的位置发现的常见氨基酸序列。未来，我们计划实际合成含有该基序的肽并进行相互作用分析。此外，我们在《Cancers》上发表了一种使用以基序为中心的磷酸蛋白质组分析来评估激酶抑制剂的方法，该方法适用于体外激酶反应。我们重新检查了在天然条件下鉴定激酶底物的方法。与变性条件相比，磷酸化效率较差，并且鉴定的激酶底物的数量明显较少，因此我们的目标是提高测定的灵敏度。为了高选择性地鉴定酪氨酸激酶的底物，我们开发并优化了一种结合金属氧化物色谱和配体交换色谱来富集酪氨酸磷酸化肽的方法。此外，我们利用深入获得的激酶底物信息和公共激酶底物信息（PhosphoSitePlus）改进了底物模型。我们预测了可被磷酸化的位点以及负责所有人类蛋白质中所有丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸位点的激酶。预测性能是根据实际用已知靶标的激酶抑制剂处理的细胞的磷酸化蛋白质组分析结果进行评估的。