mRNAのリボゾーム複合体へのバイオターゲティング

mRNA 生物靶向核糖体复合物

基本信息

批准号：
11132225
负责人：
山根恒夫
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

真核生物の高活性な翻訳系はmRNAの5′端にキャップ構造を必要とする。人為的にin vitro転写産物にキャップを付与することは可能であるが、操作が煩雑になるため、ゲノム解析レベルで要求される多検体処理を著しく困難にする。そこで、天然の植物RNAウイルスのキャップ非依存性翻訳促進配列から出発して、mRNAのリボゾーム複合体へのバイオターゲティングの観点から、その翻訳促進活性を維持したままPCRプライマーの一部にできる程度にまでにその翻訳促進配列を短少化することを目的とした。これまでの検討により、キャップ非依存性翻訳促進配列を持つと言われているタバコエッチウイルス(TEV)で高度に保存されている領域[29 bp,TE(37-65)配列と命名]が小麦胚芽抽出液を用いた翻訳反応系において、cis配列としてキャップ非依存性の翻訳を促進することを見出している。本年度はこのTE(37-65)配列を利用したcDNAの高速多検体発現系の構築をめざし、次の2点を検討した。1)PCRによる転写・翻訳制御配列の標的遺伝子への付加の効率化転写のプロモータ・ターミネータ配列とTE(35-65)配列を含むように設計したプライマー2本と、これら転写・翻訳の制御配列の一部とcDNAライブラリーのベクター部へのアニール配列とをそれぞれ持つプライマー2本の、計4本のプライマーを濃度比20:1で同時に用いてPCRを行い、cDNAライブラリー→in vitro発現用cDNAライブラリーへの迅速変換が可能であることを実証できた。2)転写と翻訳反応のシームレス連結化転写・翻訳を同時的に行わせて共役させるよりもむしろ、転写反応終了後、反応液体積の50倍容以上の翻訳反応液をそのまま系に加えるという「シーケンシャルな転写・翻訳反応」を採用するにより、迅速性と生産性を両立できた。最後にこれらの要素技術を用い、酵母cDNAの高速多検体発現に成功した。

真核生物的高度活性翻译系统需要在mRNA的5'末端具有盖结构。可以人为地授予体外转移产物的披肩，但是该操作变得复杂，这使得在基因组分析水平上需要处理多样本变得非常困难。 Therefore, from the viewpoint of bi -targeting to MRNA's bio -targeting of MRNA's revocation complex, it can be partially made into a part of the PCR primer, from the viewpoint of bi -targeting libosome complexes of natural plant RNA viruses. The purpose was缩短翻译促进序列。在检查时，高度存储在香烟蚀刻病毒（TEV）中[29 BP，TE（37-65）]，据说使用CAP非依赖性翻译促进序列。细菌提取，它发现它作为顺式序列促进了无帽的不依赖性翻译。在这个财政年度，检查了以下两个点，以便使用此TE（37-65）阵列构建cDNA的高速多层化系统。 1）通过PCR ・转录的转录效率是两个引物的翻译控制阵列和TE（35-65）序列的终止序列，以及控制和翻译控制序列。同时同时同时执行cDNA文库的矢量部分，共有四个引物，cDNA库→体外表达。可以快速转换为cDNA库。 2）转移和翻译反应的无缝转换转录・而不是同时执行同时进行翻译，从而在转移反应结束后增加了50倍或更多反应液体的翻译反应溶液。转移 /翻译反应”，我们能够达到速度和生产力。最后，我们使用这些元素技术成功地表达了酵母cDNA的高速多形象。