一細胞RT-PCRと無細胞タンパク質合成系による抗体分子スクリーニングシステムの構築

利用单细胞RT-PCR和无细胞蛋白合成系统构建抗体分子筛选系统

基本信息

批准号：
02F00507
负责人：
山根恒夫
金额：
$ 1.02万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究は一個の細胞由来のmRNAからRT-PCRにより抗体をコードするDNA断片だけを増幅し、無細胞タンパク質合成系により発現させるシステムの構築を目指している。すなわちチューブ内だけの連続した反応で抗体遺伝子(cDNA)を増幅し、抗原と結合する活性を持つ抗体分子(ここではFab断片)を無細胞タンパク質合成系で発現させ、ハイスループットにスクリーニングする新規なシステムの開発を目的としている。本研究実施の結果、以下の結果が得られた。1.抗体遺伝子のハイブリドーマ細胞からのRT-PCRによる増幅条件の検討抗体遺伝子は免疫細胞の成熟過程で遺伝子の再構成が起っており、複数のプライマーセットを用いる必要がある。また極微量の鋳型からのPCRの場合、プライマーダイマーや、ターゲット以外の配列にミスアニールすることによる、目的産物以外の増幅が顕著である。そこでまずハイブリドーマを用いて、一細胞由来mRNAからの増幅を検討した。この際副産物の増幅を押さえるのに有効なsingle primerによる増幅反応を試みた。なお用いるプライマーの配列はKabatの抗体データベースを参考に設計した。2.一細胞RT-PCRによる増幅条件の検討マウスの脾臓から、抗CD19抗体結合マグネットビーズにより抗体を産生しているB細胞を精製し、それを用いて様々な一細胞RT-PCRの増幅条件を試みた。例えば、細胞の培養日数、RTの条件、PCRのサイクル数など。細胞を培養し、3日目と4日目の場合には、増殖されたサンプルの数が多かった。最終的に、最適化的な1細胞RT-PCR増幅条件を確立した。そして、確立した増幅条件を利用し、非免疫マウスの一個B細胞から抗体L鎖を増幅させることを試みた。IgBLAST databaseおよびGENETYX-MACにより、増幅されたサンプルのシークエンスの解析を行った。その結果、得られた遺伝子は新規マウスL鎖遺伝子であった。3.マウスからの抗体の取得あらかじめ抗原を免疫したマウスの脾臓から、抗CD19抗体結合マグネットビーズにより抗体を産生しているB細胞を回収・精製した。確立した反応条件でそのB細胞を鋳型とした一細胞RT-PCRを行った。増幅した遺伝子に、無細胞タンパク質合成系での発現に必要なRNAポリメラーゼのプロモーター配列などをオーバーラップPCRにより付加し、無細胞タンパク質合成系の鋳型としてFabを発現させた。合成されたFabが抗原認識活性をELISA法により調べた。その中で活性が最も高かったFabのH鎖とL鎖のシークエンスの解析を行い、新しい抗体遺伝子が得られたことを確認した。

本研究的目的是构建一种系统，通过RT-PCR仅从单细胞来源的mRNA中扩增编码抗体的DNA片段，并使用无细胞蛋白质合成系统进行表达。换句话说，它是一种仅在试管中通过连续反应扩增抗体基因（cDNA），在无细胞蛋白质合成系统中表达具有抗原结合活性的抗体分子（此处为Fab片段），并进行高通量的新技术。目的是开发一个系统。本研究的结果得到以下结果。 1.通过RT-PCR从杂交瘤细胞扩增抗体基因的条件的检查由于抗体基因在免疫细胞的成熟过程中经历基因重排，因此需要使用多个引物组。此外，在使用极少量模板的PCR的情况下，由于引物二聚体和与靶标以外的序列的错误退火，除所需产物之外的产物的扩增是显着的。因此，我们首先研究使用杂交瘤从单细胞衍生的 mRNA 进行扩增。此时，我们尝试使用单一引物进行扩增反应，这可以有效抑制副产物的扩增。所用引物的序列是参考Kabat的抗体数据库设计的。 2. 单细胞 RT-PCR 扩增条件的检查使用抗 CD19 抗体缀合磁珠从小鼠脾脏中纯化产生抗体的 B 细胞，并用它们来评估单细胞 RT-PCR 的各种扩增条件。。例如，细胞培养的天数、RT条件、PCR循环数等。细胞培养第3天和第4天，增殖样本数量较多。最后，我们建立了最佳的单细胞 RT-PCR 扩增条件。然后，使用既定的扩增条件，我们尝试从未免疫小鼠的单个 B 细胞中扩增抗体 L 链。使用 IgBLAST 数据库和 GENETYX-MAC 分析扩增样品的序列。结果，获得的基因是一种新的小鼠L链基因。 3.从小鼠获得抗体使用抗CD19抗体缀合的磁珠，从预先用抗原免疫的小鼠的脾脏中收集并纯化产生抗体的B细胞。以 B 细胞为模板，在既定反应条件下进行单细胞 RT-PCR。通过重叠PCR将在无细胞蛋白质合成系统中表达所需的RNA聚合酶启动子序列添加到扩增的基因中，并表达Fab作为无细胞蛋白质合成系统的模板。通过ELISA方法检测合成的Fab的抗原识别活性。他们分析了活性最高的Fab的H链和L链序列，证实获得了新的抗体基因。