一細胞RT-PCRと無細胞タンパク質合成系による抗体分子スクリーニングシステムの構築

利用单细胞RT-PCR和无细胞蛋白合成系统构建抗体分子筛选系统

基本信息

批准号：
02F00507
负责人：
山根恒夫
金额：
$ 1.02万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究は一個の細胞由来のmRNAからRT-PCRにより抗体をコードするDNA断片だけを増幅し、無細胞タンパク質合成系により発現させるシステムの構築を目指している。すなわちチューブ内だけの連続した反応で抗体遺伝子(cDNA)を増幅し、抗原と結合する活性を持つ抗体分子(ここではFab断片)を無細胞タンパク質合成系で発現させ、ハイスループットにスクリーニングする新規なシステムの開発を目的としている。本研究実施の結果、以下の結果が得られた。1.抗体遺伝子のハイブリドーマ細胞からのRT-PCRによる増幅条件の検討抗体遺伝子は免疫細胞の成熟過程で遺伝子の再構成が起っており、複数のプライマーセットを用いる必要がある。また極微量の鋳型からのPCRの場合、プライマーダイマーや、ターゲット以外の配列にミスアニールすることによる、目的産物以外の増幅が顕著である。そこでまずハイブリドーマを用いて、一細胞由来mRNAからの増幅を検討した。この際副産物の増幅を押さえるのに有効なsingle primerによる増幅反応を試みた。なお用いるプライマーの配列はKabatの抗体データベースを参考に設計した。2.一細胞RT-PCRによる増幅条件の検討マウスの脾臓から、抗CD19抗体結合マグネットビーズにより抗体を産生しているB細胞を精製し、それを用いて様々な一細胞RT-PCRの増幅条件を試みた。例えば、細胞の培養日数、RTの条件、PCRのサイクル数など。細胞を培養し、3日目と4日目の場合には、増殖されたサンプルの数が多かった。最終的に、最適化的な1細胞RT-PCR増幅条件を確立した。そして、確立した増幅条件を利用し、非免疫マウスの一個B細胞から抗体L鎖を増幅させることを試みた。IgBLAST databaseおよびGENETYX-MACにより、増幅されたサンプルのシークエンスの解析を行った。その結果、得られた遺伝子は新規マウスL鎖遺伝子であった。3.マウスからの抗体の取得あらかじめ抗原を免疫したマウスの脾臓から、抗CD19抗体結合マグネットビーズにより抗体を産生しているB細胞を回収・精製した。確立した反応条件でそのB細胞を鋳型とした一細胞RT-PCRを行った。増幅した遺伝子に、無細胞タンパク質合成系での発現に必要なRNAポリメラーゼのプロモーター配列などをオーバーラップPCRにより付加し、無細胞タンパク質合成系の鋳型としてFabを発現させた。合成されたFabが抗原認識活性をELISA法により調べた。その中で活性が最も高かったFabのH鎖とL鎖のシークエンスの解析を行い、新しい抗体遺伝子が得られたことを確認した。

这项研究旨在构建一个系统，在该系统中，只有抗体编码的DNA片段是从RT-PCR源自单个细胞的mRNA中放大的，并使用无细胞蛋白质合成系统表达。换句话说，目的是开发一种新型系统，该系统仅通过管中的连续反应放大抗体基因（cDNA），表达具有与细胞无细胞合成系统中与抗原结合的活性（此处，Fab片段）的活性的抗体分子（此处，Fab片段），并在高通量中筛选它们。从本研究的实施中获得了以下结果。 1。从杂交瘤细胞中RT-PCR对抗体基因的放大条件的检查：在免疫细胞成熟过程中发生基因重排，并且必须使用多个引物组。此外，对于来自非常少量模板的PCR，非目标产物的放大是通过对底漆二聚体或靶标以外的其他序列进行误导而突出的。因此，首先，使用杂交瘤研究了来自单个细胞的mRNA的扩增。目前，使用单个底漆尝试进行扩增反应，该反应有效抑制副产品的扩增。使用的引物的序列是使用Kabat的抗体数据库设计的。 2。通过单细胞RT-PCR检查扩增条件。使用抗CD19抗体偶联的磁珠从小鼠的脾脏中纯化产生抗体的B细胞，并尝试使用这些抗体RT-PCR进行各种扩增条件。例如，培养细胞的培养天数，RT的条件，PCR的周期数等。细胞培养，并且在第3天和第4天生长的样品数量很大。最后，建立了优化的1细胞RT-PCR扩增条件。然后，使用已建立的扩增条件，我们试图从非免疫小鼠的单个B细胞中扩增抗体L链。使用Igblast数据库和Genetyx-MAC分析放大样品的序列。结果，获得的基因是一种新型的小鼠L链基因。 3。收集从小鼠B细胞中收集产生抗体的抗体，并使用抗CD19抗体偶联的磁铁珠从用抗原事先免疫的小鼠的脾脏纯化。在既定反应条件下，使用B细胞作为模板进行了单细胞RT-PCR。通过重叠的PCR，将扩增基因添加到RNA聚合酶的启动子序列中，这对于在无细胞蛋白质合成系统中表达是必不可少的，而FAB作为无细胞蛋白质合成系统的模板表示。 ELISA研究了合成FAB的抗原识别活性。我们分析了具有最高活性的FAB的H和L链的序列，以确认获得了新的抗体基因。