mRNAのリボゾーム複合体へのバイオターゲティング-効率的な無細胞遺伝子翻訳反応をめざして-

mRNA 生物靶向核糖体复合物 - 旨在实现高效的无细胞基因翻译反应 -

基本信息

批准号：
10145221
负责人：
山根恒夫
金额：
$ 1.15万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

生きた細胞から遺伝子の転写・翻訳に必要な成分のみを取り出し、これを用いて鋳型(DNAあるいはmRNA)から蛋白質を合成する“無細胞蛋白質合成システム"は、生命維持機構や生体防御機構という制約から解放されるため、生細胞を用いる“遺伝子工学的システム"より簡便で迅速であり、実験室レベルの蛋白質生合成技術として、非常に有望である。とくに小麦胚芽抽出液は原料入手が容易、調製法が簡単、という利点を有している。しかし、真核生物の翻訳系であるため、鋳型となるmRNAの5'末端には通常キャップ(cap)構造が必要である。しかし、その構造を作るために使用されるキャップアナログは非常に高価であり、また遊離のキャップアナログは翻訳反応を著しく阻害する。そこで、キャップ構造の機能を代替し、翻訳開始因子(eIF4F等)あるいは40S rRNAあるいはその複合体を特異的ターゲットとして認識し翻訳を促進するようなキャップ非依存性5'翻訳促進配列(5'TE)配列について研究した。この目的のため天然の5'TEの一種であるタバコエッチウイルス(TEV)5'UTRを出発材料として、6種類の欠失変異体を構築した。レポーター遺伝子として、ジヒドロ葉酸還元酵素をコードする遺伝子(dhfr)からの酵素の合成量を調べた。その結果、欠失変異体の中で、類縁ウイルス(ポティウイルス)間で相同性が比較的高い領域である37-65塩基[TE(37-65)配列と命名]は、キャップ非依存性の翻訳促進活性が高く、また29bpと非常に短いため、PCRのプライマーとして用いることが可能となった。また、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼやクラゲ蛍光蛋白質についても同様の結果が得られた。

“细胞蛋白质合成系统”仅消除了从活细胞转移和翻译基因并合成从模具（DNA或mRNA）合成蛋白质的基因所需的成分（DNA或mRNA），这是一种限制为生命维护组织和生命防御机制因为它是从中释放出来的，所以它比使用活细胞的“基因工程系统”更简单，更快，并且作为实验室蛋白质实时合成技术非常有前途。特别是，小麦胚芽提取物的优点是，很容易获得原材料且易于准备。但是，由于它是真核生物的翻译系统，因此需要在成型mRNA的5'末端建立正常的帽（盖）结构。但是，用于创建结构的帽类似物非常昂贵，并且游离盖类似物显着抑制翻译反应。因此，更换盖结构的功能，并将转换启动因子（EIF4F等）或40S rRNA或其复合物识别为特定目标，并且促进了翻译5'转换加速器5'转换加速器（5 'T恤）。为此，用香烟蚀刻病毒（TEV）5'UTR建造了六种类型的缺失变体，这是一种天然5 19te。作为记者基因，研究了编码可简化叶酸还原酶的基因（DHFR）的酶量。结果，37-65个碱基[TE（37-65）序列和命名]，这是一个在缺失的病毒（Potivirus）中具有相对较高的同源性的区域，因为促进翻译活动的是cap。高且非常短的29 bp，可以将其用作PCR底漆。获得了氯霉素乙酰基转移酶和水母荧光蛋白的相似结果。