植物病原糸状菌におけるトランスポゾンを用いた遺伝子ギングシステ開発

在植物病原真菌中使用转座子开发遗传系统

基本信息

  • 批准号:
    10876009
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 1.41万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    日本
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for Exploratory Research
  • 财政年份:
    1998
  • 资助国家:
    日本
  • 起止时间:
    1998 至 无数据
  • 项目状态:
    已结题

项目摘要

先に申請者らは、ユウガオつる割病菌(Fusarium oxysporumf.sp.lagenariae)から、これまで病原糸状菌では全く報告されていなかったAcタイプトランスポゾン(Tfo1と命名)を単離した。本研究では、Tfo1を用いた糸状菌の遺伝子タギング法の確立を目指し、以下の研究を行った。1. Tfo1の転写RNAと転移中間体の検出Tfolにはトランスポゼース様タンパク質の読み枠(ORF1)が存在する。ユウガオつる割病菌から、ノーザンハイブリダイゼーションとRT-PCRを用いてORF1の転写RNAを検出し、ORF1がトランスポゼース遺伝子として機能していることを示唆した。さらに、PCRを用いて、ユウガオつる割病菌の全DNAから転移中間体と考えられている環状Tfo1を検出した。また、ゲノム中に存在するTfo1の両側には、トランスポゾン挿入領域に特徴的な重複配列が存在することを確認した。以上の結果は、Tfo1が転移活性を有することを強く示唆した。2. 形質転換系を用いたTfo1の転移活性の検出β-グルクロニダーゼ(GUS)遺伝子(uidA)をレポーターとして用いて、Tfo1の転移活性の検出を試みた。全長Tfo1配列をAspergillus nidulansのgpd遺伝子プロモーター(Pgpd)とuidAの間に組み込み、Pgpd::Tfo1::uidA融合ベクターを作製した。本ベクターによる形質転換体では、Tfo1が転移した場合にのみ、GUS活性が検出されると予想された。Pgpd::Tfo1::uidAによる形質転換体の菌体抽出液のGUS活性を測定したところ、Pgpd::uidAによる形質転換体の1/1000程度の活性が検出され、その頻度は低いが、ベクターからのTfo1の切り出しと転移が起きていることが示唆された。そこで現在、この形質転換体を用いて、遺伝子タギングを試みている。
此前,申请人从尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporumf.sp)中分离到了Ac型转座子(命名为Tfo1),该转座子在病原真菌中从未报道过。在本研究中,我们进行了以下研究,旨在建立使用 Tfo1 的丝状真菌基因标记方法。 1.Tfo1转录RNA和易位中间体的检测 Tfol具有转座酶样蛋白的开放阅读框(ORF1)。使用Northern杂交和RT-PCR,我们检测到来自铜绿假单胞菌的ORF1转录RNA,表明ORF1作为转座酶基因发挥作用。此外,使用 PCR,我们从真菌的总 DNA 中检测到了环状 Tfo1,它被认为是转移中间体。我们还证实基因组中Tfo1两侧存在转座子插入区特征的重复序列。上述结果强烈表明Tfo1具有转移活性。 2.使用转化系统检测Tfo1的易位活性我们尝试使用β-葡萄糖醛酸酶(GUS)基因(uidA)作为报告基因来检测Tfo1的易位活性。将全长 Tfo1 序列插入构巢曲霉 gpd 基因启动子 (Pgpd) 和 uidA 之间,以创建 Pgpd::Tfo1::uidA 融合载体。在使用该载体的转化体中,预计只有在转移 Tfo1 时才能检测到 GUS 活性。当我们测量带有Pgpd::Tfo1::uidA的转化体的细菌细胞提取物的GUS活性时,我们检测到的活性约为带有Pgpd::uidA的转化体的1/1000,尽管频率较低,有人认为Tfo1的切除和转移因此,我们目前正在尝试使用该转化体进行基因标记。

项目成果

期刊论文数量(3)
专著数量(0)
科研奖励数量(0)
会议论文数量(0)
专利数量(0)

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