チミジンホスホリラーゼの血管新生活性の機構とその他の生理活性

胸苷磷酸化酶血管生成活性及其他生理活性的机制

基本信息

批准号：
08670183
负责人：
原口みさ子
金额：
$ 0.9万
依托单位：
Kagoshima University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08670183/
关键词：
チミジンホスホリラーゼ血管新生ジーンターゲテイング

项目摘要

チミジンホスホリラーゼは血管新生活性以外の生理活性をもっているか否かを調べる目的でジーンターゲテイングを試みている。多くの癌組織におけるチミジンホスホリラーゼの発現は周辺の正常組織に比べ高い。またいくつかの予備実験より、チミジンホスホリラーゼは血管新生活性以外にも腫瘍増殖において有利に働くような生理活性をもつと予想される。今までにマウスのチミジンホスホリラーゼ遺伝子のクローニングを終え、3種類のターゲテイングコンストラクトを作成した。そのうち一種はチミジンホスホリラーゼ遺伝子のコ-デイングリージョンをすべて欠失させたものでその部分にネオマイシン耐性遺伝子を挿入した。またネガテイブ選別をするためにジフテリアトキシンAフラグメント遺伝子をターゲテイングコンストラクトのベクター部分に挿入した。他の2種はチミジンホスホリラーゼ遺伝子の第一エクソンから第4エクソンの途中までを欠失させたものである。この部分にはチミジンホスホリラーゼの酵素活性に必須のアミノ酸が2個含まれている。また第一メチオニンは第2エクソンに含まれる。今後これらのうち2種類のコンストラクトをES細胞に遺伝子導入し、ネオマイシンによるポジティブ選別、ジフテリアトキシンによるネガテイブ選別を行った上、NheI,NdeI,MunIなど第一エクソンから第4エクソンの途中までを欠失させたことにより切断サイトが失われた制限酵素を用いてゲノミックDNAのサザンハイブリダイゼーションを行いノックアウトアレレを同定する。このES細胞をマウスの8細胞期胚に凝集法により添付させる。この胚をマウス子宮に戻してキメラマウス、ノックアウトマウスを作成する。ノックアウトマウスの表現型を正常マウスと比較する。癌を多発するLarge T antigenのトランスジェニックマウスやP53のノックアウトマウスなどとかけあわせ癌の罹患率が変化するか調べる。またチミジンホスホリラーゼは核酸の代謝においてサルベ-ジ系路で働く酵素であるが、デノボ系路の遮断薬を投与した場合にノックアウトマウスで何らかの変化がみられるか検討する。

我们已经尝试了基因靶向，以确定胸苷磷酸化酶是否具有新生血管形象以外的生理活性。在许多癌症组织中的胸苷磷酸化酶表达高于周围正常组织。同样，从几个初步实验中，预计胸苷磷酸化酶具有生理活性，除了新生血管外，这对肿瘤生长有益。迄今为止，自小鼠胸苷磷酸化酶基因克隆以来，已经创建了三个靶向构建体。其中之一是对胸苷磷酸化酶基因的所有编码区域的缺失，并将新霉素耐药基因插入到这一部分中。此外，将片段基因的白喉毒素插入了靶向构建体的矢量部分，以进行阴性选择。另外两个物种是从第一个外显子到胸苷磷酸化酶基因的第四外显子的缺失。该部分包含两个对于胸苷磷酸化酶的酶活性必不可少的氨基酸。第二个外显子也包括第一个甲硫氨酸。 In the future, two of these constructs will be transferred into ES cells, and positive selection with neomycin and negative selection with diphtheria toxin, and then Southern hybridization of genomic DNA using restriction enzymes in which the cleavage site is lost due to deletion of the first exon to the fourth exon, such as NheI, NdeI, and MunI, to identify knockout alleles.这些ES细胞通过聚集方法连接到小鼠8细胞期胚胎上。将胚胎返回到鼠标子宫中，以创建嵌合鼠标和敲除鼠标。将敲除小鼠的表型与正常小鼠进行了比较。我们将研究引起癌症发生率和p53敲除小鼠的大T抗原转基因小鼠的癌症发生率是否变化。胸苷磷酸化酶是一种在核酸代谢中起作用的酶，当给核酸的代谢中起作用，我们将调查当施用从头大道的阻滞剂时，在敲除小鼠中是否发生任何变化。