ゲルゾリンファミリー蛋白質アドセバリンの血管平滑筋細胞増殖への関与

凝溶胶蛋白家族蛋白Adsevalin参与血管平滑肌细胞增殖

• 批准号: 07770061
• 负责人: 大見 和宏
• 金额: $ 0.51万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07770061/
• 关键词: ゲルゾリン; アドセバリン; 血管平滑筋; 細胞増殖

本研究では血管平滑筋でのアドセバリンの発現機構および細胞増殖に対する役割を解明することを主たる目的として以下の実験を行い重要な知見を得た。すでに報告されている牛アドセバリンcDNA塩基配列から幾つかのアンチセンスオリゴマー及びその配列に関してセンス、ミュータントオリゴマーを作成した。そしてそれらを培養牛血管平滑筋細胞内に導入しアドセバリンの発現に対する効果を抗アドセバリン抗体を用いてのイムノブロット法及蛍光抗体法で調べた。その過程で実験に用いた抗体は分子量74Kdの幾つかの蛋白質を認識し、血管平滑筋にアドセバリンアイソフォームが存在することがわかった。その中の一つのアイソフォームは牛副腎から最初に単離されたアドセバリンと同一の機能(カルシウム依存性にアクチンフィラメントを切断する)を有することが確認された。これらのアイソフォームがmRNAから蛋白質に翻訳された後に修飾されて生じた可能性もあるため、遺伝子レベルでアドセバリンの発現を調べた。牛頚動脈平滑筋組織及そこから酵素処理により調製した単離細胞の初代培養の過程の細胞からmRNAを精製し一本鎖cDNAを作成した。そして牛副腎アドセバリンcDNA塩基配列をもとに幾つかプライマーを作成しPCRを行った。その結果牛副腎アドセバリンcDNAと分子量がほぼ同一で一部配列が異なるアイソフォームが発現していることが明らかになった。現在各クローンの全塩基配列を解析中である。そして血管平滑筋に発現しているアドセバリンアイソフォームの塩基配列一機能関連を解析し、再びアドセバリンアイソフォームcDNA塩基配列から幾つかのアンチセンスオリゴマー及びその配列に関してセンス、ミュータントオリゴマーを作成し細胞内に導入し細胞増殖に対する役割を解析する。

在本研究中，我们进行了以下实验并获得重要发现，主要目的是阐明Adsevalin在血管平滑肌中的表达机制及其在细胞增殖中的作用。从先前报道的牛 Adcevarin cDNA 序列构建了几种反义寡聚物以及正义和突变寡聚物。然后，将它们引入培养的牛血管平滑肌细胞中，并使用抗adcevarin抗体通过免疫印迹和荧光抗体方法研究它们对adcevarin表达的影响。在此过程中，实验中使用的抗体识别了几种分子量为74Kd的蛋白质，并揭示了血管平滑肌中存在Adcevarin亚型。其中一种亚型被证实与 Adsevalin 具有相同的功能，Adsevalin 最初是从牛肾上腺中分离出来的（以钙依赖性方式切断肌动蛋白丝）。由于这些亚型可能在从 mRNA 翻译成蛋白质后发生了修饰，因此我们在基因水平上研究了 Adsevalin 的表达。在牛颈动脉平滑肌组织的原代培养过程中从细胞中纯化mRNA，并通过酶处理从其制备分离细胞，并产生单链cDNA。然后，我们根据牛肾上腺Adcevarin cDNA碱基序列创建了几个引物并进行了PCR。结果表明，表达了与牛肾上腺adsevarin cDNA分子量几乎相同但序列部分不同的异构体。我们目前正在分析每个克隆的完整核苷酸序列。然后，我们分析了血管平滑肌中表达的Adcevarin异构体的核苷酸序列与功能关系，并根据Adcevarin异构体的cDNA核苷酸序列再次创建了几种反义寡聚物以及正义和突变寡聚物，并将其引入细胞中以分析其在细胞中的作用。增殖。