神経伝達物質放出の制御における細胞骨核及びその調節系の関与

细胞核及其调节系统参与神经递质释放的控制

• 批准号: 04267208
• 负责人: 中村 清二
• 金额: $ 1.09万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1992
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1992 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-04267208/
• 关键词: 神経伝達物質; アクチン; アドセバリン; cDNAクローニング

神経細胞や各種分泌細胞の細胞膜近傍にはアクチンを主体としたマイクロフィラメンとのネットワークが存在しrestingの状態では神経伝達物質やホルモン等を含む小胞の膜への接近に対するbarrierを構成している。細胞内Ca^<2+>が上昇するとマイクロフィラメントの断片化が生じ小細の膜への接近が容易になる。即ち伝達物質等の放出が促進される。Ca^<2+>濃度の上昇に応じてアクチンフィラメントの切断活性を持つようになる蛋白としてウシ副腎髄質細胞においてはゲルゾリンとアドセバリン(74KDa蛋白)が知られている。今回我々はアドセバリンに注目し,アドセバリンがin vivoにおいて細胞の興奮(ICa^<2+>Jiの上昇)に応じて実際にマイクロフィラメントを断片化し伝等物質等の放出を促進する機能を持つか否かを調べる目的で先ずアドセバリンcDNAのクローニングを行なった。アドセバリン蛋白の部分ペプチドのアミノ酸配列を決定しそれに基づいてDBApwbesを作製した。これらのプローブを用いてウシ副腎髄質cDNAライブラリーよりいくつかのクローンを得た。これらをつなぎあわせて得られたcDNAはアドセバリンのコーディング領域を全て含んでいた。予測されるアミノ酸配列(アミノ酸715個よりなる分子量約8万の蛋白である)の解析によるアドセバリンはゲルゾリンfamilyに属するがゲルゾリンとは明らかに異なる蛋白であることがわかった。palyphorpho inusitidesの結合に必要な配列も保存されていた。全コーディング領域を含むcDNAをT7プロモーターの下流につなぎ大腸菌内で発現させたところSDS電気流動上の分子量が74kDaの蛋白が得られた。この蛋白は精製しin vitro活性を調べたところ,組織より精製したアドセバリンと同様,Ca^<2+>濃度依存性にアクチンフィラメントを切断する作用を持つことがわかった。

神经细胞和各种分泌细胞的细胞膜附近存在着基于肌动蛋白的微丝网络，在静息状态下，它对含有神经递质、激素等的囊泡接近细胞膜形成屏障。当细胞内Ca 2+ 增加时，微丝变得破碎并且变得更容易接近小膜。换句话说，促进了传输物质等的释放。已知凝溶胶蛋白和adsevalin(74KDa蛋白质)响应于Ca 2+ 浓度的增加而在牛肾上腺髓质细胞中具有肌动蛋白丝切断活性。这次，我们以adsevalin为中心，研究adsevalin是否真的具有在体内响应细胞兴奋（ICa^2+Ji增加）而断裂微丝并促进转基因物质释放的功能。既然如此，我们首先克隆了Adcevarin cDNA。我们确定了 Adcevarin 蛋白的部分肽的氨基酸序列，并基于它创建了 DBApwbes。使用这些探针，我们从牛肾上腺髓质 cDNA 文库中获得了几个克隆。将它们连接在一起获得的 cDNA 包含 Adcevarin 的整个编码区。对预测的氨基酸序列（由 715 个氨基酸组成的分子量约为 80,000 的蛋白质）的分析表明，adsevalin 属于凝溶胶蛋白家族，但与凝溶胶蛋白明显不同。结合palyphorpho inusitides 所需的序列也是保守的。当含有整个编码区的cDNA连接到T7启动子下游并在大肠杆菌中表达时，获得了SDS电动分子量为74 kDa的蛋白质。当我们纯化该蛋白并检查其体外活性时，我们发现它具有以Ca 2+ 浓度依赖性方式裂解肌动蛋白丝的作用，类似于从组织中纯化的adsevalin。