血管平滑筋細胞の分化制御遺伝子の研究

血管平滑肌细胞分化调控基因的研究

• 批准号: 05857012
• 负责人: 大見 和宏
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1993
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1993 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05857012/
• 关键词: 血管平滑筋; E12; カルデスモン; alpha平滑筋型アクチン

現在血管平滑筋の研究の材料として多く利用されている培養血管平滑筋細胞に平滑筋型の細胞骨格蛋白質の減少など脱分化しているという欠点があり、平滑筋細胞の性質を検討する上で正確な実験結果を得る為にも培養血管平滑筋細胞の分化モデルを開発することが必要となっている。そこで今回の研究では多種類の細胞の核内に普遍的に存在している分化制御遺伝子の一つであるE12の血管平滑筋細胞での分化調節の機構を知ることを目的として以下の実験を行った。1、現在一般に用いられているラット大動脈初代培養平滑筋細胞、A10株化細胞の培養条件の検討を行った。また、カルデスモン、alpha平滑筋型アクチンの抗体によりウエスタンブロットを行った結果、alpha平滑筋型アクチンはかなりの発現量が認められたがカルデスモンは非平滑筋型のアイソフォームが大部分を占めていた。他の入手した抗体も検討した結果平滑筋の分化程度の指標としてまずカルデスモンの平滑筋型と非筋肉型の量比を観察し次にアクチンなどの他の細胞骨格蛋白質の量の増減を比較することを決定した。2、E12の抗体を作成する為にヒトE12cDNAを発現ベクターPGEX-3Xに導入し大腸菌内にGSTとの融合蛋白質として発現させグルタチオンアフィニテイカラム、イオン交換カラムにより精製後factorXaによりE12蛋白質を得、それをウサギに免疫することによりポリクローナル抗体を作成した。3、ヒトE12遺伝子を培養平滑筋細胞に導入する為にpRSVneo又はpMANneoベクターにヒトE12cDNAの導入を試みた。pRSVへの導入は成功しそのベクターのラット大動脈培養平滑筋細胞に導入を試みた。現在PCR,サザンブロット、ウエスタンブロットにより導入の成否を確認中である。

目前广泛用作血管平滑肌研究材料的培养血管平滑肌细胞存在去分化的缺点，例如平滑肌型细胞骨架蛋白的减少，为了获得准确的实验结果是必要的。开发培养的血管平滑肌细胞的分化模型。因此，在本研究中，我们进行了以下实验，旨在了解普遍存在于多种细胞核中的分化控制基因之一的E12调节血管平滑肌细胞分化的机制。去了。 1.我们研究了目前常用的原代培养大鼠主动脉平滑肌细胞和A10细胞系的培养条件。另外，使用针对钙结合蛋白和α平滑肌肌动蛋白的抗体进行蛋白质印迹，结果观察到相当量的α平滑肌肌动蛋白，但钙结合蛋白的非平滑肌型亚型占大多数。作为检查其他获得的抗体的结果，我们首先观察平滑肌型和非肌肉型卡尔德斯蒙的量比作为平滑肌分化程度的指标，然后比较其他细胞骨架量的增加/减少肌动蛋白等蛋白质我已经决定了。 2. 为了制备E12抗体，将人E12 cDNA导入表达载体PGEX-3X中，在大肠杆菌中表达为与GST的融合蛋白，使用谷胱甘肽亲和柱和离子交换柱纯化，然后将E12蛋白纯化使用 Xa 因子免疫兔子产生多克隆抗体。 3.为了将人E12基因导入培养的平滑肌细胞中，我们尝试将人E12 cDNA导入pRSVneo或pMANneo载体中。该载体已成功导入pRSV，我们尝试将该载体导入培养的大鼠主动脉平滑肌细胞中。我们目前正在使用 PCR、Southern blotting 和 Western blotting 来确认导入的成功或失败。

项目成果

大見和宏: "Induction of Giant Endothelial Cells in Culture by K-252ay a Protein Kinase Inhibitor" JapaneseJ. Pharmacdogy. 63. 195-202 (1993)

Kazuhiro Omi：“K-252ay 蛋白激酶抑制剂诱导培养中的巨内皮细胞”，JapanJ. 63. 195-202 (1993)。