培養および凍結精細胞を用いた顕微授精および産子の作出に関する発生工学的研究

利用培养和冷冻精子细胞进行显微授精和后代生产的发育工程研究

基本信息

批准号：
07780763
负责人：
小倉淳郎
金额：
$ 0.7万
依托单位：
国立予防衛生研究所
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07780763/
关键词：
マウス精細胞精子細胞顕微授精凍結保存

项目摘要

本研究は、顕微授精技術の医生物学へのより幅広い応用(遺伝子導入動物作成など)を可能にするために、精細胞の培養および凍結保存技術を確立することを目的とした。以下の2つの実験を並行して進めた。動物はいずれもマウスを用いた。(1)精細胞培養技術の確立: 精細胞の培養は、減数分裂依然の細胞を顕微授精可能な精子細胞まで減数分裂を終了させることを目指した。すべて株化あるいは初代セルトリ細胞との共培養を行った。精子細胞をもたない生後10日令の雄マウスより精細胞を取り出し、1-2週間培養した場合、精祖細胞の増殖は観察されたが、分化しなかった。一方、成熟雄マウスを用いた場合は、約10日後も精子細胞が観察された。精巣内の発生スケジュールを考慮するとこの細胞は精母細胞から分裂した可能性が高いが、現在確認中である。また、いづれの方法でも、FSH(卵胞刺激ホルモン)の添加が効果があった。(2)精細胞の凍結融解技術の確立: 精巣から分離した精細胞の凍結法を、グリセロール、DMSO、エチレングリコールなどを用いて検討した。その結果、7.5%グリセロール+7.5%FSCをPBSに加え-1℃/分で凍結することが良いことが明らかになった。融解後の生存率は、70-80%であった(トリパンブルーによる試験)。その正常性を明らかにするために、融解後に円形精子細胞を顕微授精に用いた。150個の2細胞期胚を6匹の偽妊娠マウスに移植した結果、すべて妊娠し、17匹(11%)の正常仔が生まれた。以上の結果から、精細胞の凍結保存が可能となり、貴重な遺伝資源の保存や顕微授精実験の省力化などに役立つであろうと思われる。

这项研究旨在建立用于培养和冷冻水平的精子细胞的技术，以使微刺激技术在医学生物学（例如创建转基因动物）中更广泛地应用。以下两个实验并联进行。所有动物都是小鼠。（1）建立精子细胞培养技术：培养精子细胞的目的是通过细胞终止减数分裂，这些细胞在可能被接管内接种内接种的精子细胞中保留。所有这些都与原代sertoli细胞进行了紧张或共培养。当从没有精子细胞的雄性小鼠中去除精子细胞并培养1-2周时，观察到精子细胞的增殖，但它们没有区分。另一方面，当使用成熟的雄性小鼠时，即使在大约10天后也观察到精子细胞。考虑到睾丸内的发育时间表，该细胞很可能与精子细胞分开，但目前正在研究中。此外，在所有方法中，添加FSH（刺激激素）都是有效的。（2）使用甘油，DMSO，乙烯乙二醇等研究了从睾丸中冻结从睾丸中分离出的精子细胞的方法的技术：结果表明，结果表明，加入7.5％的甘油 + 7.5％ + 7.5％FSC至-1°C/min min/min min/min min/min。解冻后的存活率为70-80％（用锥虫蓝色测试）。为了阐明其正态性，融化后使用圆形精子细胞进行静脉授精。将150个两细胞阶段的胚胎植入六只伪久的小鼠中，导致所有妊娠和17（11％）正常幼犬。从以上结果来看，它可能是精子细胞冷冻保存的，这将有助于保留有价值的遗传资源并减少静脉输液化实验中的劳动。