精細胞を用いた新しい遺伝子導入動物作成法の開発

开发利用精子细胞创造转基因动物的新方法

• 批准号: 09780784
• 负责人: 小倉 淳郎
• 金额: $ 1.47万
• 依托单位: National Institute of Infectious Diseases
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 1998
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09780784/
• 关键词: マウス; 精細胞; 発生工学; 顕微授精; 遺伝子導入; 精母細胞; 精子細胞; マウス; 精細胞; 発生工学; 顕微授精; 遺伝子導入; 精母細胞; 精子細胞

本研究は、精細胞を用いて効率的に遺伝子導入動物を作成する方法を開発しようとするものである。動物は主にマウスを用いている。この目的のために、(1)精細胞への遺伝子導入→(2)精細胞の体外あるいは体内培養→(3)精細胞の回収→(4)遺伝子導入精子細胞選抜および顕微授精→(5)遺伝子導入産子の出産、という一連の技術の開発が必要である。昨年度までに、精細胞の遺伝子導入および体外培養については、ある程度の成果を得た。本年度は、遺伝子導入細胞の選抜と顕微授精を成功させるための技術開発を行った。これまでの円形精子細胞を用いた顕微授精は、卵子活性化45分後から60分後までの分後までの短時間に終了させる必要があった。そこで、2減数分裂中期で停止している未受精卵へ円形精子細胞を注入し、染色体凝集をさせた後に、サイトカラシン存在下で活性化し、1個の雌性前核を除くことで二倍体胚を作成した。この胚は胚移植後に正常産子まで発生した。この方法により、(GFP) Green Fluorescent Proteinなどのマーカーをもとに導入細胞を探す時間的余裕ができ、より確実に遺伝子導入細胞由来の産子を得られると考えられる。本年度は、さらに核移植技術を用いて、精祖細胞由来のクローン胚の作成を目指した。生後6-8日令の雄マウ.スから精巣を取り出し、精細管を酵素処理することにより精祖細胞を採取し、Wakayama et al.の方法によりクローン胚を作成した。これまで120個の胚を培養し、36個(30%)が桑実期胚/胚盤胞期胚へ発生し、そのうち23個(77%)が着床した。精祖細胞は、精母細胞や精子細胞に比べて培養が容易であるので、遺伝子導入と選抜も実施できる可能性が高い。今後、本研究で得られた成果をもとに、実際に遺伝子導入動物の作成を実施する予定である。

这项研究旨在开发使用精子细胞有效产生转基因动物的方法。动物主要由小鼠使用。为此，有必要开发一系列技术：（1）基因转移到精子细胞中→（2）精子细胞的体外或重要培养物→（3）精子细胞的恢复→（4）基因转移精子细胞的选择和微疗法→（5）转基因婴儿的出生。到去年，我们已经在精子细胞的基因转移和体外培养中取得了一定程度的结果。今年，我们开发了成功选择转基因细胞和静脉授精的技术。先前使用圆形精子细胞的微启示必须在短时间内从鸡蛋激活后的45分钟到鸡蛋激活后60分钟完成。因此，将圆形精子细胞注入了未施用的卵，这些卵在两种减数分裂减数分裂中被捕，在染色体聚集后，它们在存在细胞切拉斯蛋白的存在下被激活，并去除一只雌性鼻子以产生二倍体胚胎。该胚胎在胚胎转移后形成正常出生。该方法允许根据（GFP）绿色荧光蛋白等标记来搜索转导细胞的时间，并被认为可以从转导细胞中获得更可靠的出生。今年，我们旨在进一步使用核转移技术来创建来自精子的克隆胚胎。从6-8天大的雄性慕斯中除去睾丸，并通过酶处理生精管来收集精子细胞，并使用Wakayama等人的方法制备了克隆的胚胎。迄今为止，已经培养了120个胚胎，其中36个（30％）发育到羊肚菌/胚泡胚胎中，其中23（77％）植入。由于精子细胞比精子细胞和精子细胞更容易培养，因此也可以进行基因转移和选择很可能。将来，我们计划根据从这项研究中获得的结果实际创建转基因动物。