染色体分配に関与するMukBタンパクのモーター蛋白としての機能の研究

MukB蛋白作为运动蛋白参与染色体分离的功能研究

• 批准号: 07780576
• 负责人: 仁木 宏典
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Kumamoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07780576/
• 关键词: MukBタンパク; ATP加水分解反応; Mg2+

本年度の研究目的であるMukB蛋白のATP加水分解活性を明らかにすることができた。放射性標識化ATPを用いこの加水分解産物であるADPを薄層クロマトグラフィーによって分離、検出しさらに検出したADPを定量することによって精製MukBタンパクのATP加水分解反応を明らかにすることができた。まず、このATP加水分解反応はMg2+依存性であることを明らかになった。すなわち、MukBタンパクのATP加水分解活性は1mMのMg2+存在下でみられるが、Mg2+のキレート剤である1mMEDTAをこの反応液へ添加することによりMukBタンパクのATP加水分解反応は阻害された。さらに、この中にMg2+を加えてキレート剤の影響を打ち消すと再びATP加水分解反応が観察され、このEDTAの阻害効果は見られられなくなった。MukBタンパクの精製はこのタンパクを過剰生産する菌株から行い、その検出の指標には電気泳動によるタンパクの分子量を用いてきた。MukBタンパクの精製過程の一つであるゲルろ過クロマトグラフィーで分離精製した分画でATP加水分解反応見てみたところ、MukBタンパクの溶出ピークと一致してATP加水分解反応のピークが観察された。このことからもMukBタンパクがATP加水分解活性を持つことが示唆された。酵素学的に測定したところMukBタンパクの最大反応速度(Vmax)とミカエリ定数(Km)はそれぞれ、8.4nmol/min/mg、0.13mMでありATP加水分解酵素としての活性は弱いものであった。この活性を増強させる因子の存在を探索するため野生株から細胞質画分と細胞膜画分を抽出しこれをさらにゲルろ過クロマトグラフィーで細かく再度分画した。これらの各分画を精製MukBタンパクに加え、MukBタンパクのATP加水分解活性を増強させる分画があるか調べた。しかしながら、細胞質画分と細胞膜画分ともにMukBタンパクのATP加水分解活性を増強させる分画を検出することができなかた。MukBタンパクはオペロンを形成しているMukE,Fタンパクと相互作用している可能性があらたに示唆されている。MukBタンパクのATP加水分解活性に対するこれらタンパクの影響を引き続き検討中である。

我们能够阐明MukB蛋白的ATP水解活性，这就是今年研究的目的。通过使用放射性标记的 ATP 进行薄层色谱分离和检测该水解产物 ADP，并对检测到的 ADP 进行定量，我们能够澄清纯化 MukB 蛋白的 ATP 水解反应。首先，我们发现该 ATP 水解反应依赖于 Mg2+。即，在1mM Mg 2+ 存在下观察到MukB蛋白的ATP水解活性，但通过向该反应溶液中添加1mM MEDTA(Mg 2+ 螯合剂)，MukB蛋白的ATP水解反应受到抑制。此外，当向其中添加Mg 2+ 以抵消螯合剂的作用时，再次观察到ATP水解反应，并且不再观察到EDTA的抑制作用。 MukB蛋白已从过量产生该蛋白的菌株中纯化出来，并且通过电泳测定的蛋白的分子量已被用作其检测的指标。当我们观察使用凝胶过滤色谱法（MukB 蛋白的纯化方法之一）分离和纯化的级分中的 ATP 水解反应时，我们观察到 ATP 水解反应峰与 MukB 蛋白的洗脱峰一致。这也表明MukB蛋白具有ATP水解活性。酶促测定的结果是，MukB蛋白的最大反应速率(Vmax)和米氏常数(Km)分别为8.4nmol/min/mg和0.13mM，其作为ATP水解酶的活性较弱。为了寻找增强这种活性的因子的存在，我们从野生型菌株中提取了细胞质部分和细胞膜部分，并使用凝胶过滤色谱法再次将它们精细分级。将这些级分中的每一个添加到纯化的MukB蛋白中，并研究是否任何级分增强MukB蛋白的ATP水解活性。然而，不可能在细胞质和细胞膜部分中检测到增强MukB蛋白的ATP水解活性的部分。最近有人提出 MukB 蛋白可能与 MukE 和 F 蛋白相互作用形成操纵子。我们正在继续研究这些蛋白对 MukB 蛋白 ATP 水解活性的影响。