染色体改変変異株によるバクテリア環状ゲノム構造の構築原理の解明

利用染色体修饰突变体阐明细菌环状基因组结构的构建原理

基本信息

批准号：
14014251
负责人：
仁木宏典
金额：
$ 3.65万
依托单位：
National Institute of Genetics
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14014251/
关键词：
大腸菌核様体セントロメア染色体工学分配

项目摘要

塩基配列が解読されたバクテリアゲノムを巧妙な遺伝学的手法を使い大規模に改変することが可能となった。このような染色体レベルでの変異株の体系的な解析により、細胞内でバクテリア染色体を構築するための機構を解き明かすことができると期待できる。まず染色体の一部を切り出しシス機能部位を失った染色体をもつ変異株の作成し、染色体分配おける核様体構造の変化について調べた。大腸菌染色体上oriCの近傍の84.7minから0.1minにわたる720kbの領域を切りだした染色体分断株では染色体分配に異常が認められた。蛍光核染色により核様体の局在を観察したところ、この染色体分断株は無核細胞を生じる事はないもののしばしば小さな核様体と大きな核様体に不均等に分かれた核様体をもつ細胞が観察された。また細胞内のoriCの局在性を蛍光in situハイブリダイジェーション法により解析した結果、核様体の異常が認められた染色体分断変異株では複製したoriCの両極方向への移動が阻害されていた。これらの結果より、染色体の84.7minから0.1minの範囲内にoriC領域の移動に関わるシス領域が存在するものと結論した。さらに、欠失変異株やプラスミドによる細胞内局在性の解析方法を組み合わせて、最終的に大腸菌の染色体分配においてDNA分配にシス位で機能している領域を25bpまで特定することができた。染色体を構築にどのような影響を知るためには、細胞内での染色体構造を知ることが必須である。この目的のため、生細胞での染色体の可視化を試み、これに成功しバクテリア生細胞での核様体の動的な構造変化を明らかにすることができた。この方法により、さきの25bp領域を欠失した変異株では確かに核様体が細胞周期を通じて卵型を保ち野生型のような動的な形態変化が失われていた。染色体上のシス領域により核様体構造が変化することを初めて明らかにした。

现在可以使用复杂的遗传技术对已测序的细菌基因组进行大规模修改。通过在染色体水平上对突变菌株进行系统分析，我们有望阐明细胞内细菌染色体的构建机制。首先，我们切除了染色体的一部分，创建了染色体失去顺式功能位点的突变株，并研究了染色体分离过程中核仁结构的变化。在染色体破坏菌株中观察到异常染色体分离，其中大肠杆菌染色体上 oriC 附近从 84.7 分钟延伸到 0.1 分钟的 720 kb 区域被切除。当我们使用荧光核染色观察类核的定位时，我们发现虽然这种染色体分裂不产生无核细胞，但它经常观察到不均等地分为小核细胞和大核细胞。此外，利用荧光原位杂交分析了oriC在细胞中的定位，结果发现，在具有异常核仁的染色体破坏突变体中，复制的oriC向两极的迁移受到抑制。根据这些结果，我们得出结论，在染色体的84.7分钟至0.1分钟的范围内存在参与oriC区域运动的顺式区域。此外，通过结合使用缺失突变体和质粒的细胞内定位分析方法，我们最终能够鉴定出最多 25 bp 的区域，该区域在大肠杆菌染色体分离中的 DNA 分离顺式位置上发挥作用。为了了解对染色体构建的影响，有必要了解细胞内染色体的结构。为此，我们尝试可视化活细胞中的染色体，并成功阐明活细菌细胞中核仁的动态结构变化。使用这种方法，我们发现在删除前 25 bp 区域的突变株中，类核在整个细胞周期中保持椭圆形，并且缺乏野生型中所见的动态形态变化。我们首次揭示了核仁结构的变化取决于染色体上的顺式区域。