PACAPとVIP受容体のキメラによるリガンド結合の選択性を決定する部位の同定

确定 PACAP 和 VIP 受体嵌合体配体结合选择性的位点

• 批准号: 07772169
• 负责人: 橋本 均
• 金额: $ 0.7万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07772169/
• 关键词: PACAP; VIP; 受容体; キメラ; リガンド; cyclic AMP

1.PACAP受容体およびVIP受容体キメラの作製キメラ受容体は、両受容体のエキソンとイントロンの境界部分で入れ替えた構造とし、N末細胞外領域からC末方向に、順に5か所を境界点に選択した。キメラ受容体cDNAは、リコンビナントPCR法により作製した。また得られたcDNAに変異がないことを、DNAシークエンス解析により確認した。2.キメラ受容体の機能作製したcDNAおよび野生型受容体cDNAをCOS7細胞にDEAE-デキストラン法により一過性に発現させ、粗細胞膜画分に対する[125-I]PACAP-27結合能を測定した。さらに、各受容体の発現細胞を各ペプチドホルモンで刺激した後、細胞内cyclic AMP産生を測定することにより、リガンド結合の特異性を調べた。なお作製した全てのキメラ受容体は、リガンド結合と細胞内cyclic AMP産生の最大反応において野生型PACAP受容体およびVIP受容体と同等の活性を有しており、受容体としての機能は完全に保持されていた。3.その結果次の各点が明らかになった。(1)PACAP受容体の結合にもっとも大きく関与する部分は、N末細胞外領域の一部に存在する。(2)VIP受容体によるVIPの結合の決定にもN末細胞外領域が大きく関与している。(3)一方、C末側の細胞外ループや細胞膜貫通領域にもPACAPあるいはVIPが認識される部分が存在する。(4)受容体のリガンド結合と細胞内情報伝達系の活性化に関与する領域が、必ずしも一致しない場合がある。4.今後、本研究の結果特定されたリガンド結合に関与する領域において、点突然変異の導入等によりさらに詳細な解析を進めて行く予定である。

1。创建PACAP受体和VIP受体嵌合体的创建嵌合受体是由外显子边界部分和两个受体内含子的互换构造的，并选择了五个边界点，以从C-末端方向的N末端细胞外区域进行顺序选择。通过重组PCR制备嵌合受体cDNA。此外，通过DNA测序分析证实了cDNA的结果。 2。嵌合受体和野生型受体cDNA的功能性cDNA在COS7细胞中通过deae-dextran方法瞬时表达，并测量[125-I] PACAP-27与粗细胞膜馏分结合[125-I] PACAP-27。此外，通过刺激用每种肽激素表达每个受体的细胞，然后测量细胞内循环AMP产生来检查配体结合的特异性。在配体结合和细胞内循环AMP产生的最大反应中，所有产生的嵌合受体的活性与野生型PACAP和VIP受体相似，并且它们作为受体的功能得到了完全保留。 3。结果，揭示了以下点：（1）最有可能与PACAP受体结合的部分位于N末端细胞外区域的一部分。 （2）N末端细胞外区域也很大程度上参与了通过VIP受体确定VIP结合。 （3）另一方面，在识别PACAP或VIP的C-末端侧的细胞外环和跨膜区域中也有部分。 （4）涉及受体配体结合和细胞内信号系统激活的区域不一定是重合的。 4。将来，我们计划通过在本研究结果识别的配体结合区域中引入涉及的配体结合区域中的点突变进行进一步的详细分析。

项目成果

Aino,H.: "Structure of the gene encoding the mouse pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide receptor." Gene. 164. 301-304 (1995)

Aino,H.：“编码小鼠垂体腺苷酸环化酶激活多肽受体的基因的结构。”