PACAPとVIP受容体のキメラによるリガンド結合の選択性を決定する部位の同定

确定 PACAP 和 VIP 受体嵌合体配体结合选择性的位点

• 批准号: 07772169
• 负责人: 橋本 均
• 金额: $ 0.7万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07772169/
• 关键词: PACAP; VIP; 受容体; キメラ; リガンド; cyclic AMP

1.PACAP受容体およびVIP受容体キメラの作製キメラ受容体は、両受容体のエキソンとイントロンの境界部分で入れ替えた構造とし、N末細胞外領域からC末方向に、順に5か所を境界点に選択した。キメラ受容体cDNAは、リコンビナントPCR法により作製した。また得られたcDNAに変異がないことを、DNAシークエンス解析により確認した。2.キメラ受容体の機能作製したcDNAおよび野生型受容体cDNAをCOS7細胞にDEAE-デキストラン法により一過性に発現させ、粗細胞膜画分に対する[125-I]PACAP-27結合能を測定した。さらに、各受容体の発現細胞を各ペプチドホルモンで刺激した後、細胞内cyclic AMP産生を測定することにより、リガンド結合の特異性を調べた。なお作製した全てのキメラ受容体は、リガンド結合と細胞内cyclic AMP産生の最大反応において野生型PACAP受容体およびVIP受容体と同等の活性を有しており、受容体としての機能は完全に保持されていた。3.その結果次の各点が明らかになった。(1)PACAP受容体の結合にもっとも大きく関与する部分は、N末細胞外領域の一部に存在する。(2)VIP受容体によるVIPの結合の決定にもN末細胞外領域が大きく関与している。(3)一方、C末側の細胞外ループや細胞膜貫通領域にもPACAPあるいはVIPが認識される部分が存在する。(4)受容体のリガンド結合と細胞内情報伝達系の活性化に関与する領域が、必ずしも一致しない場合がある。4.今後、本研究の結果特定されたリガンド結合に関与する領域において、点突然変異の導入等によりさらに詳細な解析を進めて行く予定である。

1。由PACAP受体和VIP受体嵌合体制成的嵌合体受体应由Exonson和两个受体的内含子之间的边界代替。通过重组PCR方法创建嵌合体受体cDNA。另外，通过DNA序列分析证实获得的cDNA没有突变。 2。功能性cDNA和野生型受体cDNA通过deae-dextran瞬时表达COS7细胞，并测量[125-I] PACAP-27结合能力。此外，在用每种肽激素刺激每个受体的细胞后，通过测量细胞内循环AMP的产生来检查配体键的特异性。在配体键和细胞环状AMP的最大反应中，所有创建的嵌合体受体都具有与野生型PACAP受体相同的活性，并且完全维持了作为受体的功能。 3。结果，揭示了以下几点。 （1）PACAP受体键的最大部分存在于N端细胞的某些外部区域。 （2）N端细胞极大地参与了通过VIP受体确定VIP结合。 （3）另一方面，有一部分在细胞外环和C.末端的细胞膜穿透区域中识别出PACAP或VIP。 （4）涉及受体配体键的区域以及细胞内信息传输系统的激活可能并不总是匹配的。 4.将来，在本研究的结果中，在指定的配体键所涉及的领域，我们计划通过引入点突变进行更详细的分析。

项目成果

Aino,H.: "Structure of the gene encoding the mouse pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide receptor." Gene. 164. 301-304 (1995)

Aino,H.：“编码小鼠垂体腺苷酸环化酶激活多肽受体的基因的结构。”