脳機能のオプトジェネティクス研究へ向けた高汎用性ノックインマウスラインの確立

建立用于脑功能光遗传学研究的高度通用的敲入小鼠系

• 批准号: 22659051
• 负责人: 橋本 均
• 金额: $ 1.94万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
• 财政年份: 2010
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2010 至 2011
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22659051/
• 关键词: オプトジェネティクス; 神経細胞; マウスES細胞

遺伝子工学と光学を組合せて神経細胞を観察・制御するオプトジェネティクス研究が、脳神経回路の形成と動作原理を理解するうえで有効であるものと期待されている。このため、ミリ秒オーダーの高速に神経細胞を脱分極させる藻類の青色光感受性・陽イオンチャネル(channelrhodopsin-2,ChR2)が応用されている。そこで本研究ではCre-loxPシステムを用いて特定の脳領域・細胞種(特定のニューロンやグリアなど)にChR2を高発現できるノックインマウスの作製を目指している。そして、これが汎用性と精度が高く、脳研究に有用な遺伝子改変マウスであることを検証することを目標とする。2010年度の進捗状況と成果は、次に示す通りである。1)強力でユビキタスに働くプロモーターCAGを用いたChR2ターゲットノックインES細胞(マウスES細胞E14株)の相同組換え体について、DNA組換え酵素Creによる発現調節を、in vitroのレベルで確認した。2)上記(1)の解析によって、既に作成したコンストラクトでも、期待されるレベルの発現が得られる可能性が確認された。したがって、計画中の変異型のlox配列を用いた新たなターゲティングコンストラクトの作製よりも、現有クローンについての解析を先行し、変異マウスの発生をできるだけ前倒しして、実施することにした。3)ES細胞クローンのChR2の機能確認のため、未分化なES細胞クローン(ただしCre-loxP組換え体)、あるいは我々が作製したセロトニン神経細胞誘導法によって分化後の細胞について、蛍光タンパクVenusによる蛍光、電気生理学的解析、免疫染色法等による解析を実施した。

可以预期，将基因工程和光学的光学遗传学研究结合在一起，可以观察和控制神经元细胞，将有效理解神经回路的形成和操作原理。因此，已经应用了蓝色光敏阳离子阳离子通道（Channelrhopopsin-2，ChR2），该通道已应用于高速上的神经元，以毫秒的顺序去极化神经元。因此，本研究旨在创建可以使用CRE-LoxP系统在特定的大脑区域和细胞类型（例如特定神经元和神经胶质）中表达CHR2的敲门小鼠。目的是验证这是一种高度用途和准确的转基因小鼠，对大脑研究很有用。 2010财年的进展和结果如下：1）使用有效的无处不在启动子CAG的ChR2靶标ES细胞（小鼠ES ES菌株E14）的同源重组的体外水平在体外确认了DNA重组酶CRE的表达调节。 2）以上（1）中的分析证实了即使在已经创建的结构中也可以获得预期表达水平的可能性。因此，我们决定先于当前克隆的分析并尽早移动突变小鼠的发展，而不是使用计划的突变体形式的LOX序列创建新的靶向构建体。 3）为了确认CHR2在ES细胞克隆中的功能，我们使用血清素神经元诱导方法分化了未分化的ES细胞克隆（但是CRE-LOXP重组）或细胞，该方法是由荧光蛋白质金星，电生理学分析，免疫染色等产生的。