脳機能のオプトジェネティクス研究へ向けた高汎用性ノックインマウスラインの確立

建立用于脑功能光遗传学研究的高度通用的敲入小鼠系

• 批准号: 22659051
• 负责人: 橋本 均
• 金额: $ 1.94万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
• 财政年份: 2010
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2010 至 2011
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22659051/
• 关键词: オプトジェネティクス; 神経細胞; マウスES細胞

遺伝子工学と光学を組合せて神経細胞を観察・制御するオプトジェネティクス研究が、脳神経回路の形成と動作原理を理解するうえで有効であるものと期待されている。このため、ミリ秒オーダーの高速に神経細胞を脱分極させる藻類の青色光感受性・陽イオンチャネル(channelrhodopsin-2,ChR2)が応用されている。そこで本研究ではCre-loxPシステムを用いて特定の脳領域・細胞種(特定のニューロンやグリアなど)にChR2を高発現できるノックインマウスの作製を目指している。そして、これが汎用性と精度が高く、脳研究に有用な遺伝子改変マウスであることを検証することを目標とする。2010年度の進捗状況と成果は、次に示す通りである。1)強力でユビキタスに働くプロモーターCAGを用いたChR2ターゲットノックインES細胞(マウスES細胞E14株)の相同組換え体について、DNA組換え酵素Creによる発現調節を、in vitroのレベルで確認した。2)上記(1)の解析によって、既に作成したコンストラクトでも、期待されるレベルの発現が得られる可能性が確認された。したがって、計画中の変異型のlox配列を用いた新たなターゲティングコンストラクトの作製よりも、現有クローンについての解析を先行し、変異マウスの発生をできるだけ前倒しして、実施することにした。3)ES細胞クローンのChR2の機能確認のため、未分化なES細胞クローン(ただしCre-loxP組換え体)、あるいは我々が作製したセロトニン神経細胞誘導法によって分化後の細胞について、蛍光タンパクVenusによる蛍光、電気生理学的解析、免疫染色法等による解析を実施した。

光遗传学研究结合基因工程和光学来观察和控制神经元，有望有效了解大脑神经回路的形成和工作原理。为此，应用了藻类的蓝光敏感阳离子通道（通道视紫红质2，ChR2），它可以以毫秒级的高速使神经元去极化。因此，在本研究中，我们的目标是利用Cre-loxP系统来产生能够在特定脑区域和细胞类型（例如特定神经元和神经胶质细胞）中高表达ChR2的敲入小鼠。目标是验证这种转基因小鼠具有高度通用性和准确性，并且对大脑研究有用。 2010 财年的进展和结果如下所示。 1) 使用强大且普遍存在的启动子 CAG，在体外水平证实了 DNA 重组酶 Cre 对 ChR2 靶标敲入 ES 细胞（小鼠 ES 细胞系 E14）同源重组体的表达调节。 2)上述(1)中的分析证实，即使使用已经制备的构建体也可以获得预期的表达水平。因此，我们决定分析现有的克隆并尽可能地促进突变小鼠的产生，而不是使用计划的突变lox序列创建新的靶向构建体。 3) 为了确认ES细胞克隆中ChR2的功能，我们使用荧光蛋白Venus进行荧光分析、电生理分析、免疫染色等测试了未分化的ES细胞克隆（Cre-loxP重组体）或使用我们的血清素神经元诱导方法分化的细胞。进行了。