三次元培養肝細胞とその重症肝障害治療への応用

三维培养肝细胞及其在治疗严重肝损伤中的应用

基本信息

批准号：
06770390
负责人：
山口泰
金额：
$ 0.7万
依托单位：
Juntendo University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06770390/
关键词：
三次元培養肝細胞コネクチン

项目摘要

本年度の研究にて達成できたことを、研究計画に記載した順に示す。1:培養条件の設定肝細胞はコラゲナーゼ法によってラットより分離し、環流液の酸素化やその他の工夫によって、約90%程度の細胞生存率を達成できた。培養皿には、0.01%のPVLAをコートすることにより、細胞の強固な接着が得られた。また、培養液に、Epidermal Groth Factorを50μg/dlとInsulinを100nM添加することにより、肝細胞の3次元構造の構築が容易になった。2:細胞増殖と形態変化の観察上記の条件で、肝細胞を1X10^6個/60mmDishで培養開始すると、48時間後にPVLA上で、肝細胞の集合体が多層化し、96時間後に直径約100μmの多層性の肝細胞集合体が形成された。この、spheroid形成の過程で、肝細胞接着蛋白であるコネクチンの変化を観察した。方法は、培養後の経過によって得られたspheroidをアルコール固定し、コネクチン32の抗体を用いた蛍光抗体間接法にて調べた。コネクチンは培養経過とともに徐々に増加し、培養48時間をピークに約一週間にわたって観察された。この変化は、肝細胞doublet cellでは24時間でコネクチンが消失したことと比べると、spheroid cellが肝組織により近い性格を持っていることを示唆するためと考えられた。3:、4:、5:についてはただいま検討中で、まだ有意義な結果が出ていない。また、上記1:、2:の結果は現在投稿中である。

在研究计划的顺序显示，今年的研究中所取得的成就。 1：通过胶原酶方法将培养条件的肝细胞与大鼠分离，并且环形生存率约为90％。通过在培养皿上涂上0.01％的PVLA，获得了强烈的细胞胶。此外，通过在培养溶液中添加50μg/dL和100nm表皮球状因子的胰岛素，构建肝细胞的三维结构变得更加容易。 2：在上述条件下的细胞增殖和形态变化的观察，当肝细胞以1x10^6片/60 mmdish的速度开始，肝细胞在48小时后的PVLA上进行多层次，而直径为96小时。形成细胞。在球体形成的过程中，观察到连接蛋白的变化，即肝细胞粘附蛋白。该方法是固定从培养后的进度获得的酒精，并使用Connectin 32抗体使用荧光抗体不完整的整合方法。连接素在整个培养过程中逐渐增加，并在一周内观察到48小时的培养。认为这种变化表明肝细胞双细胞表明，与连接蛋白在24小时内消失相比，球体细胞比肝组织更接近肝组织。 3：4 :::::我们目前正在考虑它，但我们尚未取得有意义的结果。上述1：和2 ::的结果当前已发布。