不平等電界中におけるDNA濃縮を利用した遺伝子導入法の開発

不等电场DNA浓度的基因转移方法的开发

基本信息

  • 批准号:
    06750825
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 0.58万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    日本
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
  • 财政年份:
    1994
  • 资助国家:
    日本
  • 起止时间:
    1994 至 无数据
  • 项目状态:
    已结题

项目摘要

DNAを濃縮するための高周波不平等電界を印加するために、まず、直角のエッジをもつアルミテープを1mmの間隔で配置した電極を作成した。この電極を用いて大腸菌縣濁液に1MHz、150Vの高周波電圧を印加したところ、電極のエッジにおいて大腸菌が濃縮され、同時にパールチェーンが形成されることが確かめられた。また、プラスミドDNAを含む水溶液について同様な実験を行った結果、電極のエッジ付近においてDNAの濃縮が観察された。したがって、高周波電界を印加することにより大腸菌近傍の局所的なDNA濃度が上昇していると考えられる。そこで、高周波電界を印加した後に高電圧パルスを加えることにより、大腸菌に対する遺伝子導入効率を高めることを試みた。導入実験を行うために、高周波電界用の電極に加え、その垂直の方向に電気穿孔用のパルスを印加する電極を設置した。この電極における高周波電界無印加時の遺伝子導入効率を評価を行ったところ、1800V,時定数8msの減衰波パルスを印加することにより、DNA1μgあたり約1×10^8コロニーの導入効率が得られた。そこで、高周波印加電極に1MHzの電界を加え、導入効率への影響を解析した。高周波印加電圧を50V、100V、150Vと変化させた結果、50Vでは遺伝子導入効率に対する効果が見られず、一方、150Vでは大腸菌の生存率が低下する結果として導入効率も減少した。100Vの高周波電界を加えた場合には、高周波電界による遺伝子導入効率の有意な向上が見られた。また、印加時間の導入効率への影響を評価したところ、30秒の印加時間では高周波印加の効果は十分見られなかった。一方、120秒の印加では導入効率は却って低下するために、100V,60秒の高周波印加が最適であると思われる。その際には無印加時の約2倍にあたるDNA1μgあたり約2×10^8コロニーの導入効率が得られた。
为了施加高频不等电场来浓缩 DNA,他们首先制作了由铝带制成的电极,其直角边缘以 1 毫米的间隔排列。当使用该电极向大肠杆菌悬浮液施加1MHz和150V的高频电压时,证实大肠杆菌集中在电极的边缘,同时形成珍珠链。此外,用含有质粒DNA的水溶液进行类似的实验,结果在电极边缘附近观察到DNA浓度。因此,认为通过施加高频电场,大肠杆菌附近的局部DNA浓度增加。因此,我们尝试通过在施加高频电场后施加高压脉冲来提高基因转移到大肠杆菌中的效率。为了进行引入实验,除了用于高频电场的电极之外,还安装了用于在垂直方向上施加用于电穿孔的脉冲的电极。当我们评估该电极在不施加高频电场时的基因转移效率时,我们发现通过施加1800 V的衰减波脉冲和8 ms的时间常数,我们获得了大约1 x 10每 1 μg DNA ^8 个菌落。因此,我们在高频施加电极上增加了1MHz的电场,并分析了其对引入效率的影响。将高频施加电压改变为50V、100V、150V的结果是,在50V时未观察到对基因转移效率的影响,而在150V时,大肠杆菌的存活率下降,导致传输效率降低。当施加100V高频电场时,由于高频电场,观察到基因转移效率显着提高。此外,当评价施加时间对引入效率的影响时,在施加时间为30秒的情况下没有观察到高频施加的充分效果。另一方面,如果施加电压120秒,则引入效率降低,因此施加100V、60秒的高频电压似乎是最佳的。当时,我们获得了每 1 μg DNA 大约 2 x 10^8 菌落的转染效率,大约是不施加电压时的两倍。

项目成果

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